环靶明对前列腺癌PC3细胞株生长的影响及其作用机制研究*

冷 俊，周 晔，施利琴，张 莉

(上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科，上海 202150)

近年来，由于人均寿命的增加及诊疗水平的提高，前列腺癌发病率呈显著增长趋势。我国前列腺癌患者在初诊后多采用雄激素阻断为主的综合治疗，但是这类患者经过一定时间后，许多病例仍将进展为雄激素非依赖性的前列腺癌，生存期明显缩短，目前缺乏有效的干预手段[1]。鉴于前列腺癌对老年男性健康已造成了重大威胁，因此当前对前列腺癌研究的一个重要方面在于进一步阐明雄激素非依赖性前列腺癌的发病机制以及寻找更加有效的治疗药物。

环靶明(cyclopamine)是一种来源于藜芦属植物的甾体生物碱，有文献[2]报道环靶明可通过抑制Hedgehog信号通路来抑制癌细胞的增殖、侵袭和转移。本研究采用环靶明干预体外培养的雄激素非依赖性PC3细胞株，观察其对PC3细胞生长的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人前列腺癌PC3细胞株购自中国科学院细胞库；环靶明购自美国Biomol International公司；碘化丙啶(PI)、Annexin V凋亡试剂盒，胰蛋白酶购自美国Sigma公司；总RNA抽提试剂TRizol为Invitrogen产品；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；F12培养基为Gbico产品；PCR platinum Mix购自Tiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将PC3细胞培养于F12培养基，内含10 ml/dl的胎牛血清，青、链霉素100 U/ml，置于37℃，5 ml/dl CO2，100%饱和湿度的孵箱内培养。视细胞生长情况换液、传代。

1.2.2 MTT比色法：取对数生长期的PC3细胞接种于96孔培养板中，每孔约含2×104个细胞，放入培养箱，待细胞贴壁后，分5组进行实验：终浓度为1，5，10和15 μmol/L的环靶明组和只加F12培养液的空白组，每组设3个复孔。继续培养，在24，48和72 h各时间点分别取一板进行测定。空白孔调零，490 nm波长测定各孔吸光度A值。环靶明对细胞增殖活性的影响用抑制率表示(抑制率=1-细胞存活率，细胞存活率=实验组平均A值/对照组平均A值)。

1.2.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞周期：取对数生长期的PC3细胞，以1×105个/ml的密度接种于6孔培养板内，加药处理，方法同上，环靶明的最终浓度为1，5，10和15 μmol/L，空白组不加任何药物；将培养板放入CO2孵箱中继续培养，于72 h后回收细胞。以胰酶消化法收集并4℃离心 (1 000 r/min×5 min)细胞，PBS清洗3次，70 ml/dl冰乙醇固定，用RNase A(终浓度为0.1 g/L)消化30 min，加入0.05 g/L碘化丙啶(PI)250 μl，室温避光染色30 min后上机检测。

1.2.4 流式细胞仪(FCM)测定细胞凋亡率：按检测细胞周期方法加药处理细胞72 h后，用不含EDTA的胰酶进行消化(防止出现假阳性)，收集细胞，用预冷的PBS洗两遍。加入500 μl Binding Buffer重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻轻混匀，室温避光反应15 min，在1 h内上机检测。

1.2.5 Real-time PCR检测Gli1，Bax和Bcl-2的mRNA表达水平：实验组分别加入终浓度为1，5，10和15 μmol/L的环靶明混合培养液，对照组加入等量F12培养液，于72 h后收集细胞。用Trizol试剂抽提细胞总RNA，按TaKaRa公司的SYBR Prime Script RT- PCR Kit说明书进行逆转录和实时荧光PCR。采用20 μl反应体系， 应用Light Cycler (Roche Diagnostics公司)进行荧光定量分析。以GAPDH为内参，上游引物：5’-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3’，扩增长度为123bp；Gli1上游引物：5’-AGCTAGAGTCCAGAGGTTCAA-3’，下游引物：5’-TAGACAGAGGTTGGGAGGTAAG-3’，扩增长度为102bp；Bax上游引物：5’-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3’，下游引物：5’-GATCATCCTCTGCAGCT CC-3’，扩增长度为138bp；Bcl-2上游引物：5’- TGTGTGGAGAGCGTCAACAG-3’，下游引物：5’-TCCACAAAGGCGTCCCAGC-3’，扩增长度为237bp，以 2-ΔΔCt值分析结果。

2 结果

2.1 环靶明对PC3细胞增殖的影响 见图1。MTT结果显示：在1 μmol/L的环靶明组中，PC3细胞的增殖未受到明显抑制，而经5，10和15 μmol/L的环靶明处理后，PC3细胞的生长抑制率明显升高，且与药物浓度高低和作用时间长短呈一定正相关关系。

图1 PC3细胞在经环靶明作用不同时间后的细胞生长抑制率

2.2 环靶明对PC3细胞周期的影响 见表1。流式细胞仪分析显示，PC3细胞经药物处理后，1，5 μmol/L环靶明组的各期细胞数量无明显变化，而10和15 μmol/L环靶明组G0/G1期细胞数量逐渐增加，S期、G2/M细胞数量下降。

2.3 环靶明对PC3细胞凋亡率的影响 环靶明作用于PC3细胞72 h后，对照组，1，5，10和15 μmol/L组的凋亡率分别为3.55%±0.46%，4.97%±1.27%，7.54%±1.19%，12.47%±2.11%，24.15%±3.40%。除1 μmol/L组以外(t=1.820，P=0.143)，其余各组与对照组相比，差异均有统计学意义(t=5.414，7.159，10.413；P=0.018，0.002，0.000)，且随着浓度的升高，凋亡率显著增加。

表1 PC3细胞在经环靶明作用72 h后细胞周期的变化

2.4 环靶明对细胞中Gli1，Bax和Bcl-2的mRNA表达影响 经环靶明作用72 h后，Gil1的mRNA表达水平有下降趋势，但与对照组相比，仅15 μmol/L组的差异有统计学意义(F=1.932)；除1 μmol/L组以外，其他药物浓度干预组Bax的mRNA表达水平均显著增加(F=133.750)，Bcl-2的mRNA表达水平显著下降(F=13.518)，差异有统计学意义(P<0.05)，且有一定的剂量效应关系。

(*P<0.05 vs 对照组，** P<0.01 vs 对照组，n=3)

3讨论近年来Hedgehog信号通路在前列腺癌发生发展中的作用受到越来越多的重视。正常情况下，在胚胎发育成熟后，Hedgehog信号通路便进入了失活状态。在某些因素的作用下，Hedgehog信号通路被异常激活，可引起C-myc，VEGF等下游靶基因的表达，导致细胞增殖过度，诱发肿瘤[3]。文献报道Hedgehog信号通路的异常活化可诱发多种内胚层肿瘤，如：非小细胞肺癌、食道癌、胃癌、结肠癌等[4-6]。同样作为内胚层起源的前列腺癌中亦存在相似的变化[7]。

由于前列腺癌中存在Hedgehog信号通路的异常激活，那么环靶明作为Hedgehog信号通路拮抗剂有可能会成为治疗前列腺癌的有效药物。本研究用MTT法证实，经5，10和15 μmol/L的环靶明处理后，可有效抑制体外培养的PC3细胞生长增殖活性，且抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关关系，与熊永江等[8]人的报道一致。

本研究还用流式细胞术检测环靶明对PC3细胞周期和凋亡率的影响，低浓度的环靶明(1，5 μmol/L)作用72 h对PC3的细胞周期影响不明显，自10 μmol/L起，环靶明可将PC3细胞阻滞于G1期，G0/G1期细胞数量逐渐增加，S期、G2/M细胞数量逐渐下降。陈新宇等[9]人报道8 μmol/L环靶明作用48h对PC3细胞周期分布影响较弱，两者间的差异可能与药物浓度高低和作用时间长短有关系。5，10，15 μmol/L环靶明作用PC3细胞72 h后，细胞的凋亡率明显增加，说明环靶明可诱导其凋亡，且随着药物浓度增大，细胞凋亡率升高，有一定的浓度依赖关系。文献报道[10]，环靶明处理前列腺癌DU145细胞后凋亡率亦明显升高，升高程度与药物浓度呈正相关，与本研究结果类似。

本研究进一步检测了Hedgehog通路下游转录因子Gli1和凋亡相关基因Bax，Bcl-2的mRNA表达水平。Bax和Bcl-2是线粒体凋亡途径中重要的调控蛋白，Bax可诱导细胞凋亡，而Bcl-2则抑制细胞凋亡，两者的平衡在决定细胞是否发生凋亡中起重要作用[11]。在许多肿瘤中存在Bcl-2表达升高，而Bax表达下降[12-13]。本研究发现，经5，10和15 μmol/L环靶明处理72 h后，PC3细胞中Bax的 mRNA表达水平显著上升，而Bcl-2的mRNA表达水平则显著下降，两者的平衡被打破，对细胞凋亡的发生有促进作用。Gil1的mRNA表达水平有下降趋势，但与对照组相比，仅15 μmol/L组的差异有统计学意义，推测在环靶明抑制PC3细胞株生长的过程中，Hedgehog信号通路的下调可能并非占主导作用。

综上所述，本研究证明环靶明对前列腺癌PC3细胞株的增殖有明显抑制作用，其作用机制可能与影响细胞周期、提高Bax和下调Bcl-2基因表达水平、进而诱导细胞凋亡有关，为寻找非雄激素依赖性前列腺癌的治疗药物提供了一定的实验依据。