风湿性心脏病伴房颤患者血浆sVCAM-1水平和eNOSmRNA表达与心内血栓形成的相关性研究*

张 萍，杨 静

(陕西省商洛市中心医院检验科，陕西商洛 726000)

风湿性心脏病(rheumatic heart disease，RHD)是一种由链球菌感染引起的自身免疫性疾病[1]。研究认为，RHD长期、反复的发作可能导致心瓣膜损伤，同时引起心房颤动，且伴发心房血栓、脑卒中事件等[2]，尤其是左心房内血栓脱落容易引起栓塞性疾病的发生[3]。研究认为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)可能参与血栓形成的病理过程[4]。可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)的差异性表达可能增加血管内皮细胞的炎性反应进而促进血栓形成[5]。本文通过检测RHD患者血浆sVCAM-1水平和eNOSmRNA的表达，探讨其变化与心内血栓形成的关系，进而为RHD的治疗提供依据。

1材料和方法

1.1 研究对象 收集2015年7月～2018年7月在陕西省商洛市中心医院心内科住院治疗的58例RHD患者的血液及临床资料进行回顾性分析。其中包括二尖瓣病变者48例，二尖瓣、主动脉瓣联合瓣膜病变者10例，均并发心房颤动。心功能分级( NYHA)为Ⅱ-Ⅲ级。所有患者依据心动超声检查结果是否有心内血栓分为血栓组和无血栓组。血栓组28例(血栓位于左心耳者22例、左心室者6例)，其中男性12例，女性16例，平均年龄50.6±11.7岁。无血栓组30例，男性12例，女性18例，平均年龄49.9±12.2岁。排除标准：冠心病、甲状腺功能亢进、糖尿病、肿瘤、炎症性疾病、肝肾功能不全及其他自身免疫性疾病患者。风湿性心脏病诊断依据中华医学会风湿热诊断和治疗指南[6]。房颤的诊断均经心电图和动态心电图证实。图1A显示RHD二尖瓣膜狭窄，无血栓形成；图1B显示RHD有左室附壁血栓形成。对照组33例，均为同期体检健康者，男性14例，女性19例，平均年龄49.3±12.7岁，无血栓病和家族史，2周内未服用任何药物。各组研究对象的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究通过本院伦理委员会批准，并得到所有参与者的知情许可。

图1A 风心病二尖瓣膜狭窄 图1B 风心病左室附壁血栓形成

1.2 试剂和仪器 美国GE公司生产的Vivid Five型彩色超声诊断仪。日本Sysmex CA-7000全自动凝血仪测定血浆D-D水平。德国西门子公司试剂盒进行酶联免疫吸附试验。RNA提取使用美国Invitrogen公司产品。PCR试剂盒采用上海久盛医疗用品有限公司产品。

1.3 方法 收集所有参与者的临床资料(性别，年龄和血压)。采用彩色超声诊断仪分析RHD患者的左房内径及心瓣膜病变。血浆总RNA提取采用Trizol法，eNOSmRNA的表达采用RT-PCR检测。血浆sVCAM-1水平检测采用酶联免疫吸附试验。

1.3.1 标本采集：所有参与者禁食12 h采集静脉血，离心分离血浆，D-D和sVCAM-1水平于2 h内检测，另取2 ml血浆保存于-80℃供测定eNOSmRNA备用。

1.3.2 eNOSmRNA表达检测：血浆总RNA提取采用Trizol法，按照制造商的说明操作。mRNA的表达检测采用TaqMan RNART-PCR。单链cDNA的合成采用TaqMan RNA特异性反转录引物，利用RNA特异引物和TaqMan MGB探针扩增。内参照采用β-actin。eNOSmRNA引物序列为，正义链：5’-GCCTCCCTGAGACCCTTTA-3’，反义链：5’-GTGTCGTGGAGTCGGCA-3’，扩增产物长度为330 bp。β-actin的引物序列为正义链：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，反义链：5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’；产物长度为670bp。PCR反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，50个循环后，于4℃结束反应。将扩增产物进行电泳。通过紫外分光仪扫描得出eNOSmRNA和β‐actin的吸光度，以β‐actin的吸光度为参考，求出eNOSmRNA吸光度的变化值(△Ct)，以2-△Ct得到eNOSmRNA的相对表达量。

2结果

2.1 各组LAD，血浆D-D水平和SBP比较 见表1。与对照组比较，血栓组和无血栓组的左房内径(LAD)明显增大，血栓组增大更显著。与对照组比较，血栓组和无血栓组的D-D水平明显高于对照组，其中血栓组增高更显著，两两比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。各组间收缩压(SBP)的比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组LAD，D-D和SBP比较

注：与对照组比较，#P<0.01，■P<0.01，*P>0.05，●P>0.05；与无血栓组比较，▲P<0.01，★P>0.05。

2.2 各组血浆sVCAM-1 和eNOSmRNA结果比较 见表2。与对照组比较，血栓组和无血栓组sVCAM-1水平明显上调，而eNOSmRNA表达则明显下调。与无血栓组比较，血栓组sVCAM-1水平明显上调，而eNOSmRNA表达则明显下调。两两比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。

表2 各组sVCAM-1和eNOSmRNA结果比较

注：与对照组比较，#P<0.01，■P<0.01；与无血栓组比较，▲P<0.01。

2.3 相关性分析 在血栓组和无血栓组中，sVCAM-1水平分别与D-D水平和LAD具有正相关性(r=0.839，0.799，P<0.01)，而eNOSmRNA表达与D-D水平和LAD则具有负相关性(r=-0.829，-0.782，P<0.01)。

2.4 ROC曲线分析 见图2。以血栓组和无血栓组为因变量，sVCAM-1和eNOSmRNA的AUC分别为0.853(95%CI：0.747～0.960，P<0.01)，0.846(95%CI：0.736～0.957，P<0.01)。sVCAM-1和eNOSmRNA诊断血栓形成的敏感度和特异度分别为70.3%和81.5%，77.3%和85.7%。以上提示血浆sVCAM-1和eNOSmRNA对评价RHD血栓的形成有诊断意义。

图2 sVCAM-1和eNOSmRNA的ROC曲线

3讨论风湿性心脏病的发病在我国比较常见，其常常并发心房颤动，可能导致心内血栓的形成。尤其是心内栓子脱落能引起严重不良心脑血管事件，如急性心肌梗死和中风等[7]。既往的研究认为血管内皮细胞一氧化氮(NO)浓度下降会引起血管痉挛、血液中血小板黏附和聚集等，这些因素可能导致血栓形成风险的增加[8]。有报道认为心房颤动的病理过程可能导致血管内皮细胞损伤，进而降低NO浓度[9，10]。eNOS是内皮细胞合成NO的限速酶，其诱导心血管系统内源性NO的产生[11]。研究证实房颤患者eNOS活性的下调可能损伤内皮细胞分泌NO的能力[9]。eNOS的低表达会造成纤溶酶原激活物抑制剂-1的表达上调[12]，该产物造成纤溶系统失衡，容易诱发血栓性疾病，增加栓塞性疾病发生的风险[13]。有文献报道eNOS表达水平的变化可能与RHD患者左心房血栓形成有关。其作用机制可能因为RHD的病理过程造成二尖瓣瓣膜口面积减小、左心房容量及左心房收缩期内径增大等。这些病理变化提示患者处于机械性瓣膜梗阻状态，进而引起左心房血流瘀滞、心室血流剪切力下降以及左心房内皮细胞损伤等，最终降低eNOS的表达及其生物活性，同时增加心内血栓形成的风险[14-15]。孙富强等[16]选择39例行瓣膜置换术的风湿性心脏病患者进行研究，结果发现并发房颤的患者心房组织中eNOS表达显著下调。本研究结果显示RDH患者血浆eNOSmRNA的表达显著下调，提示RDH患者过多的并发症(房颤，二尖瓣病变等)可能是血栓形成的风险因素。eNOSmRNA在RHD两病例组中的差异性表达提示血栓组患者心内血栓存在不稳定性，增加的血栓脱落风险容易导致栓塞性疾病的发生。因此，循环eNOSmRNA活性的检测可预测RDH患者心内血栓的形成，评价栓子脱落的风险。

VCAM-1在白细胞运输中发挥重要作用，其表达增加与许多慢性炎症性疾病有关，并且可能诱发RDH患者左房血栓的形成与进展[17-18]。VCAM-1由内皮细胞分泌，脱膜后进入血液，可导致血浆sVCAM-1浓度显著增高[19]。CHEN等[20]认为VCAM-1的过表达，可能与RHD心房颤动的发生和维持有关。GORTON等[21]研究认为持续的炎症过程可增加RHD的发病率和该疾病的严重程度。进一步地研究发现RHD大鼠模型心脏瓣膜的单核细胞浸润有助于打破免疫耐受，最终导致心脏瓣膜内皮细胞的损伤并增加内皮细胞中VCAM-1的表达。本研究结果显示无血栓组血浆sVCAM-1水平显著高于对照组，提示RDH的病理过程中伴随有炎性反应的发生并且可能存在炎性血栓形成的风险。血栓组sVCAM-1水平的显著增加，提示该标志物对RDH心内血栓的病变进展有一定的诊断价值，其差异性的表达显示血栓可能存在脱落的风险。

应用彩色超声诊断仪的研究显示RHD患者心脏各腔室均有增大，尤其是心房[22]。预防RHD的并发症心房颤动或改善心房颤动引起的心肌纤维化可能显著缓解左心房内径的扩大[7]。我们的研究显示RHD患者血栓组患者LAD明显增大，与上述报道相符。相关性的分析显示sVCAM-1和eNOSmRNA分别与LAD有显著相关性，推测两标志物可能与风湿性心脏病的病理变化密切相关。D-二聚体在血浆中有较好的稳定性，其水平的差异变化可以反映体内的血栓形成以及纤溶活性亢进状况。增高的D-二聚体水平被证实与体内的高凝状态及血栓前状态有关[23]。本研究显示RDH患者血浆D-二聚体水平显著增高，其中心内血栓形成患者增加更显著，提示血栓组患者体内纤溶活性亢进，可能引起血栓脱落导致栓塞性疾病的发生。相关性分析也证实了sVCAM-1及eNOSmRNA与D-二聚体之间的相关性，推测两标志物与RDH心内血栓的形成有关，可能参与了该病变过程的进展。ROC曲线的分析显示，血浆sVCAM-1和eNOSmRNA对于诊断RDH心内血栓的形成呈现较高的灵敏度和特异度，尤其对栓子脱落的预测有诊断意义。

因此，RDH患者血浆sVCAM-1水平和eNOSmRNA表达的检测可用于评价体内的凝血活性及纤溶活性，预测血栓形成的风险，并为RDH的治疗提供依据。