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HPLC-MS/MS法检测骨髓移植患者全血环孢素A(CsA)浓度及与AM1和AM4N代谢产物的相关性研究*

2019-05-05孙文利王红春刘红星

现代检验医学杂志 2019年2期
关键词:骨髓移植血药浓度全血

王 磊,孙文利,刘 瑞,王红春,刘红星,2

(1.河北燕达陆道培医院,河北三河 065201;2.北京陆道培血液病研究院,北京 100176)

关键字:环孢素;高效液相色谱-串联质谱法;血药浓度;代谢产物

环孢素A(cyclosporine A,CsA)为多肽结构,主要作为免疫抑制剂使用,用于骨髓移植患者的抗排异和移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD的治疗和预防[1-2]。由于CsA治疗窗窄,毒性反应大,易导致移植失败,进行CsA血药浓度监测就显得尤为重要。目前监测CsA血药浓度的方法较多[3-10],高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS法)[6-10]作为CsA血药浓度监测的金标准,在欧美国家临床实验室被广泛使用,较为著名的有Mayo clinic,Lab Test Directory,Quest Diagnostics和西雅图移植中心。但由于其仪器昂贵,自动化程度低,需要专业的人员操作,故在国内临床实验室应用较少。CsA在患者体内有30多种代谢产物,代谢产物的量和活性各异,目前尚无相应的体内实验证明其差异[1-10]。其体内代谢产物研究最多的有5种,分别为AM1,AM1c,AM4N,AM9和AM19,含量最多的为AM1,含量最少的为AM4N,两者在患者个体内代谢情况目前尚无详细数据可查,对其研究就显得尤为必要。本文就CsA在骨髓移植患者体内代谢进行研究,采用HPLC-MS/MS法对移植患者各时间点全血样本进行CsA和AM1及AM4N血药浓度检测,确定其相应关系,为研究CsA个体内代谢差异提供理论依据;同时对不同移植患者全血样本进行CsA和AM1及AM4N血药浓度检测,确定其相应关系,为研究CsA个体间代谢差异提供理论依据。

1材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 CsA个体内代谢:选择2018年6月21日前来我科做CsA药物代谢研究的骨髓移植患者黄某,男,年龄15岁,诊断为急性淋巴细胞白血病(ALL),患者每天早8点晚20点服药,分别于服药后0,1,2,3,4,6,8,10和12 h抽取静脉血,共收集其18份全血样本用于CsA血药浓度测定,用HPLC-MS/MS方法对其全血样本进行CsA及AM1和AM4N浓度检测。

1.1.2 CsA个体间代谢:随机选择2018年6月21日前来我科做CsA药物代谢研究的骨髓移植患者20例全血样本,采用HPLC-MS/MS方法对其全血样本进行CsA及AM1和AM4N浓度检测。

1.2 试剂与仪器 试剂与仪器详见本实验室前期建立的同时测定骨髓移植患者全血CsA和AM1[17];AM4N(HPLC Grade,Toronto Research)。

1.3 方法 本实验室前期已建立同时测定骨髓移植患者全血中CsA和AM1的方法[8],同时AM4N的质谱条件为AM4N:m/z 1 206.1~1 188.9,DP:70V,CE:19V;其它质谱条件和色谱条件与CsA和AM1相同。

1.4 统计学分析 利用SPP 16.0分别对个体内与个体间全血CsA,AM1和AM4N进行相关性分析,同时利用雷达图进行各自比率分析。

2结果

2.1 色谱质谱行为 在以上色谱质谱条件下,测得AM4N二级碎片离子质谱图,见图1。CsA,AM1,AM4N,CsD质谱色谱图,见图2。AM4N的保留时间为3.57 min,以CsD为内标,AM4N峰面积与CsD峰面积比值(Y)对AM4N浓度(X)进行线性回归,得AM4N回归方程:Y=0.001 89X-0.009 65(r=0.993 7),经方法学考察线性范围、回收率、精密度、基质效应及稳定性均符合检测要求,最低定量限为1.0 ng/ml,可用于定量分析。各峰型良好,无杂质峰干扰。

图1 AM4N的二级扫描碎片离子图 图2 CsA,AM1,AM4N及CsD质谱色谱图

2.2 HPLC-MS/MS法同时检测个体内CsA,AM1和AM4N血药浓度结果 该骨髓移植患者不同时间点的18例全血样本CsA,AM1和AM4N血药浓度检测结果,见图3。由图3可知,该骨髓移植患者CsA代谢产物AM1在不同时间点含量均较大,而代谢产物AM4N在不同时间点含量均较小,这和以往研究结果一致[1-8]。对不同时间点的CsA,AM1和AM4N比率结果作雷达图进行各自比率关系分析见图4。可见,该患者一天内不同时间点AM1/CsA的比率大,同时波动也较大(0.28~1.34),而AM4N/CsA和AM4N/AM1相应的比率关系较好,比率范围分别为0.04~0.14和0.06~0.23。由图4可知,也可进一步说明AM1在CsA代谢产物中占比较大,而AM4N在CsA代谢产物中占比较小。对三者进行相关性分析(见图5)可知CsA和AM1的相关性较差(r=0.79),与本实验室前期研究结果一致[7-8],而AM4N和CsA及AM1在该患者体内一定程度上存在相关性(r>0.9)。

图3 HPLC-MS/MS法检测CsA,AM1和AM4N血药浓度结果 图4 CsA,AM1和AM4N比率

图5 相关性分析

2.3 随机选择的骨髓移植患者20例全血样本CsA,AM1和AM4N血药浓度检测结果 见图6。由图6可知,随机选择的20例骨髓移植患者样本CsA代谢产物AM1在不同个体检测值波动较大(3~146),而代谢产物AM4N在不同个体检测值波动较小。对不同个体间的CsA,AM1和AM4N比率结果作雷达图进行各自比率关系分析见图7。可见,不同个体间AM1/CsA的比率波动也较大(0.05~1.20),而AM4N/CsA和AM4N/AM1相应的比率关系较好,比率范围分别为0.009~0.05和0.01~0.39。由图7可知,也可进一步说明AM1在CsA代谢产物中占比较大,而AM4N在CsA代谢产物中占比较小。对三者进行相关性分析(见图8)可知,个体间CsA和AM1的相关性较差(r=0.59),AM4N和CsA及AM1在个体间不存在相关性(r<0.5)。

图6 HPLC-MS/MS法检测不同个体间CsA,AM1和AM4N血药浓度结果 图7 不同个体间CsA,AM1和AM4N比率

图8 个体间结果相关性分析

3讨论本文在王磊等[8]人的“HPLC-MS/MS法在骨髓移植患者全血CsA及AM1浓度测定中的应用”一文的基础上,增加了CsA的代谢产物AM4N的检测,明确了CsA在骨髓移植患者个体内不同时间点的代谢差异,进一步确定了AM1是CsA在骨髓移植患者体内代谢的最主要代谢产物,其占比高,含量大,且与CsA浓度的相关性较差。同时发现AM4N在CsA代谢产物中占比小,含量低,但其与CsA和AM1的相关性却较好。同时,通过对个体间的CsA,AM1和AM4N血药浓度检测,也进一步证实了AM1是CsA的主要代谢产物,其含量大,但是与CsA的比例关系差别较大,同时有文献报道AM1又具有生物活性[16-17],这就解释了为什么CsA在移植患者中有效浓度会有差异,AM4N在个体间的代谢比率有差异,但其总含量小,生物活性也低,对CsA有效血药浓度范围的影响较小。总之,不论CsA在个体内还是个体间代谢,其主要代谢产物AM1含量都较高,且差异较大,严重影响CsA有效血药浓度范围,而AM4N含量都较小,不影响CsA有效血药浓度范围。本文通过对骨髓移植患者个体内和个体间的CsA和AM1及AM4N血药浓度的检测,说明了CsA在骨髓移植患者体内代谢存在个体差异,同时也要求检测CsA血药浓度的检测方法必须特异性强[9-10],才能避免CsA代谢产物的干扰。

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