荭草苷对APP/PS1转基因痴呆小鼠认知功能和海马自噬的影响

钟 轶，郑晴予，贾 宁，孙承艳，韩 锟

(锦州医科大学 1. 附属第一医院神经内科、2. 基础医学院解剖学教研室，辽宁 锦州 121001)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)为一种年龄相关的神经退行性疾病，是最常见的痴呆类型。目前认为AD发病伴随着严重自噬损害，主要表现为自噬底物降解受阻，自噬溶酶体堆积[1]，细胞中β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)、tau蛋白等自噬体内待降解的物质堆积，引起细胞毒性损害，导致AD的发生[2]。

荭草苷(orientin)是一种碳苷类黄酮化合物，为荭草、竹叶、金莲花的主要活性成分。研究表明，荭草苷能够改善Aβ以及噪音诱导的痴呆小鼠的认知功能[3-4]。但荭草苷改善痴呆鼠认知功能的机制尚不清楚。本研究拟初步探讨荭草苷通过改善APP/PS1转基因小鼠自噬功能，从而改善认知功能，寻找潜在的AD防治药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 7月龄SPF级APPswe/PS1△E9双转基因♀小鼠16只，同月龄的♀C57BL/6J小鼠8只，购自中国医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(辽)2008-005。

1.1.2药物与试剂 荭草苷(纯度≥98%)，购自成都曼思特；Aβ抗体，购自CST；LC3、Beclin-1抗体，购自武汉三鹰； p62、组织蛋白酶D(Cathepsin D)抗体，购自沈阳万类生物；DAB、通用SP试剂盒，购自北京中杉金桥。

1.1.3仪器 Morris水迷宫(安徽正华生物)；显微镜(日本Olympus)；电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与处理 将16只APP/PS1转基因小鼠随机分为转基因对照组(transgenic control group, Tg)和荭草苷处理组(Tg+Ori)，每组8只；8只同月龄C57BL/6J小鼠作为非转基因对照组(non-transgenic control group, NT)。荭草苷组连续30 d每天腹腔注射生理盐水稀释的荭草苷(10 mg·kg-1)，Tg和NT组给予同剂量的生理盐水。由于转基因鼠不易获得，因此本课题未设置荭草苷多个剂量组，仅初步探讨荭草苷的药理作用，未探索最佳给药剂量。

1.2.2水迷宫行为学检测 给药结束24 h后，进行Morris水迷宫实验，实验分为定位航行和空间探索实验两部分，实验过程参照Vorhees等[5]方法。

1.2.3取材 小鼠行为学检测结束后，以水合氯醛麻醉，生理盐水左心室灌注后断头取脑，一半置于多聚甲醛中行后固定，用于免疫组化染色；另一半取海马，置于-80 ℃低温冰箱储存，用于免疫印迹检测。

1.2.4免疫组化检测Aβ的表达 小鼠脑经石蜡包埋、切片后，脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，Aβ抗体(1 ∶800)4 ℃孵育过夜，生物素化二抗、辣根酶标记卵白素孵育，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片后，显微镜下观察摄片。

1.2.5免疫印迹检测海马自噬相关蛋白表达 海马组织剪碎后，以RIPA缓冲液和超声裂解细胞，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭2 h， p62、LC3、Cathepsin D、Beclin-1抗体(1 ∶500)4 ℃孵育过夜，二抗孵育2 h，ECL发光。

1.2.6统计学分析 以软件SPSS 16.0进行统计学分析，多组比较用F检验。方差齐，两两比较用q检验，方差不齐用Dunnett检验。

2 结果

2.1 荭草苷改善APP/PS1转基因小鼠空间学习和记忆功能如Fig 1A所示，各组小鼠逃避潜伏期随训练天数的增加，均有逐渐下降的趋势。与NT组相比，Tg组小鼠逃避潜伏期延长(P<0.01)；与Tg相比，Tg+Ori组逃避潜伏期缩短(P<0.05)。各组小鼠的游泳速度无差异(Fig 1B)。表明转基因小鼠空间学习能力受损，荭草苷能够改善转基因小鼠空间学习能力。

如Fig 1C、1D所示，与NT组相比，Tg组小鼠穿过平台象限的次数和所处时间均减少(P<0.01)；与Tg组相比，Tg+Ori组小鼠穿过平台象限的次数和所处时间均增加(P<0.05)。表明转基因小鼠记忆能力降低，荭草苷能够改善转基因小鼠空间记忆能力。

Fig 1 Cognition of APP/PS1 mice improved by orientin treatment n=8)

A: Spatial learning and memory were assessed by the measurement of escape latency; B: Swimming speed was assessed; C, D: The number of times entered the target zone and the time spent in it during 120 s probe trail; E: Representative swimming paths on day 8 of training.#P<0.05,##P<0.01vsNT;*P<0.05,**P<0.01vsTg.

2.2 荭草苷改善APP/PS1转基因小鼠海马Aβ沉积Fig 2的Aβ免疫组化染色结果显示，与NT组相比，Tg组小鼠海马出现大量的Aβ阳性染色区域(P<0.01)；与Tg组相比，荭草苷组小鼠Aβ阳性染色所占面积百分比降低(P<0.01)。表明Tg小鼠表现为海马Aβ沉积，荭草苷能够减少转基因小鼠海马Aβ沉积。

Fig 2 Amyloid plaques of APP/PS1 mice reduced by orientin treatment n=4)

A:Brain sections were stained with an anti-Aβ antibody (×400); B: The relative area occupied by Aβ was measured##P<0.01vsNT;**P<0.01vsTg.

2.3 荭草苷对APP/PS1转基因小鼠海马自噬相关蛋白表达的影响为了探究荭草苷对小鼠自噬的影响，检测自噬典型标记物LC3、p62、Beclin-1和Cathepsin D的表达。如Fig 3所示，与NT组相比，Tg组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、p62、Cathepsin D表达升高(P<0.05，P<0.01)；与Tg组相比，荭草苷组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、p62、Cathepsin D表达降低(P<0.05)。组间Beclin-1表达无差异。提示转基因小鼠自噬体堆积，荭草苷能够调控转基因小鼠自噬，促进自噬底物降解。

3 讨论

目前AD确切的病因和致病机制仍不清楚，Aβ瀑布理论仍然是最广为接受的发病机制假说[6]。

Fig 3 Effects of orientin on autophagy related proteins in hippocampus of APP/PS1 mice n=4)

#P<0.05,##P<0.01vsNT;*P<0.05vsTg

APP/PS1转基因小鼠是把人源性的APPswe和PS1△E9基因敲入到小鼠基因组中，能够较好地模拟AD患者的临床表现和病理改变[7-8]，是研究AD的可靠模型。研究表明，荭草苷具有抗衰老、抗炎、抗抑郁、抗氧化应激、增强自噬[9]、抑制凋亡等作用[10]，这些均与AD的发病密切相关。因此，荭草苷可能是一个潜在的多靶点作用的AD防治药物，但荭草苷治疗AD的确切机制仍不是很清楚。认知功能障碍是AD最重要的临床表现。本研究提示，荭草苷能够减少APP/PS1转基因小鼠脑Aβ沉积，从而改善学习记忆功能。

自噬是存在于真核细胞生物中保守的细胞内物质降解方式，能够选择性吞噬降解细胞内受损细胞器、易聚集蛋白、病原体等有害物质，并释放营养成分，维持细胞内稳态。近期研究表明，包括AD在内的表现为蛋白异常聚集的神经退行性疾病，其发病往往伴随着脑部自噬损害，主要表现为自噬内容物降解受阻、自噬溶酶体堆积[1]。LC3是典型的自噬标志物之一，在自噬体形成和成熟中起着重要作用，自噬体形成过程中，胞质型LC3酶解形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)结合，转变为存在于自噬体的膜型LC3-Ⅱ， LC3-Ⅱ蛋白表达能够反映细胞内成熟自噬体的数量，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬水平的变化[11]。对小鼠海马LC3检测结果提示，Tg组小鼠海马LC3-Ⅱ表达(结果未列出)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均升高，提示转基因AD小鼠海马自噬体数量增加，自噬处于高水平。p62能够识别、连接待降解自噬内容物，并通过与LC3-Ⅱ的连接，将自噬内容物募集到自噬体内[12]。p62检测结果表明，组间p62变化趋势和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的结果一致，表现为Tg组p62表达升高，荭草苷组p62表达下降。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62下降的原因可能是自噬诱导降低或(和)自噬溶酶体降解增加。为了明确自噬水平降低的原因，分别对自噬诱导及降解相关蛋白Beclin-1和Cathepsin D进行检测。Beclin-1在调控自噬体生成中起着不可或缺的作用[13]，其蛋白表达能够反映自噬诱导水平。本实验结果表明，各组间Beclin-1蛋白表达无差异，提示各实验组动物的自噬诱导无差异，即荭草苷组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62的下降可能并非自噬诱导水平下降所致。Cathepsin D是人体内唯一天冬氨酸蛋白水解酶，通过降解自噬溶酶体和内吞体中未折叠或氧化性聚集蛋白，在维持神经元细胞内稳态中起着不可替代的作用。Cathepsin D有3种构型：存在于高尔基复合物的分子质量为53 ku的无活性的前体蛋白，转运至内吞体后修饰成为分子质量为48 ku的具有酶活性的单链蛋白中间体，以及进一步转运至溶酶体并修饰成为分子质量为31 ku的具有酶活性的成熟双链结构[14]。本实验结果提示，Tg组成熟型Cathepsin D、LC3-Ⅱ和p62均升高，与Lee等[15]的研究结果一致，荭草苷组均表现为降低，提示APP/PS1小鼠海马未降解的自噬溶酶体增多，荭草苷能够促进自噬内容物降解，改善转基因AD小鼠脑部自噬溶酶体底物堆积。

本实验结果表明，荭草苷能促进APP/PS1转基因小鼠脑自噬底物降解、减少自噬体堆积，进而减少脑内Aβ沉积，从而改善学习记忆障碍。因此，荭草苷可能是一个潜在的多靶点作用的AD防治药物。

(致谢：本实验在锦州医科大学生命科学院公共实验平台完成，感谢王宇教授的指导和帮助)