稀释液及解冻条件对湖羊冻精质量的影响

吕松洁，张树山，戴建军，孙玲伟，葛 雷，梁 菲，张德福*

(1上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；3上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；4浙江省医学科学院生殖生理研究所，杭州 310013)

21世纪以来，人工授精技术越来越多地应用在畜牧生产上，在集约化、规模化生产中效果突出。冻精便于储存和运输，减少空间和时间对人工授精的制约，可大大提高良种的利用率，对繁育工作有重要意义[1]。家畜精液冷冻技术研究始于1952年，由Polge[2]等首次成功应用并繁育出小牛，之后在猪、牛等家畜上得到广泛应用[3-4]。我国于20世纪70年代开始研究山羊和绵羊精液冷冻技术，解冻后活率约35%[5]。人工授精受胎率低是目前绵羊冻精推广应用面临的主要问题。影响受胎率的因素有很多，一方面绵羊精子易受化学毒性、温度变化、氧化、渗透压和细胞机械等损伤[6]，另一方面冻精稀释液、冻精制作和解冻程序等各个环节均影响冻精品质[7]。湖羊是皮、毛、肉兼用的绵羊品种，经济效益高，在我国分布范围广，本研究拟在前期相关工作基础上，通过交叉试验，进一步筛选最佳稀释液配方和最适解冻条件，为提高湖羊的精液冷冻技术提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取上海永辉羊业有限公司的4头健康、2.5岁、性成熟的湖羊种公羊，圈养，每日定时饲喂精饲料和草料。

1.2 稀释液配制

稀释液的配方如表1所示。1、2、3、5、6、7号稀释液配制方法为：称取各成分，定容至100 mL，混匀；取80 mL，加入20 mL卵黄，混匀；取94 mL，加入6 mL甘油，混匀；加入双抗200 IUmL。4号稀释液配制方法为：称取各成分，定容至85 mL，混匀；加入15 mL卵黄，混匀；再取94 mL，加入6 mL甘油，混匀；加入双抗200 IUmL。1—7号稀释液配置后，按每份15 mL进行分装，-20 ℃保存。

表1 湖羊冻精冷冻稀释液配制

1.3 精液处理

1.3.1 精液采集

采用假阴道法采集4头种公羊精液于试管中，37 ℃水浴恒温保存，现场立即进行常规品质检查[8]，活力达到80%以上的精子用于后续试验操作。

1.3.2 精液稀释

将4头种公羊的精液混匀，均分7份，精液与稀释液比例为1∶3，向各组精液中添加相应配方稀释液，轻轻混匀，37 ℃水浴10 min，4 ℃条件缓慢降温，平衡2.5 h。

1.3.3 精液冷冻

在4 ℃条件下抽取0.2 mL各精液样品，置于0.25 mL细管中，封口。迅速将细管置于液氮上方3 cm处，熏蒸15 min，之后迅速将细管投入液氮中冷冻保存。

1.3.4 精液解冻

冻存的细管精液经不同温度及时间解冻，经过预试验后，确定了试验条件范围，分别为70 ℃ 3 s、70 ℃ 5 s、70 ℃ 8 s、42 ℃ 15 s、42 ℃ 17 s、42 ℃ 20 s。擦除细管表面水珠后，剪掉两端，收集精液于对应的1 mL稀释液中，37 ℃孵育30 min。

1.4 精液品质检测

1.4.1 精子活率和活力检测

使用一次性精子计数板(迈朗，SJ-TMDI608)进行精子活率和活力检测。将解冻并孵育30 min的精液轻轻混匀，取15 μL精液滴在37 ℃预热的计数板上，于200倍光学显微镜下随机选择5个视野，精子分析仪(迈朗，SJ-TMDI608)自动识别运动精子、直线运动精子和死亡精子数量，经计算后形成活率和活力数据。活率为运动精子占总精子数的比例，活力为直线运动精子占总精子数的比例。

1.4.2 精子质膜完整率检测

采用低渗肿胀法(HOST)检测精子质膜完整性[9]。取10 μL解冻精液加到100 μL 经37 ℃预热的HOST低渗溶液(0.9 g果糖、0.49 g柠檬酸钠、溶于100 mL双蒸水中)中，37 ℃水浴1 h，于200倍光学显微镜下随机选择5个视野，计算弯尾精子数占总精子数的比例。

1.4.3 精子顶体完整率检测

采用考马斯亮蓝法检查精子顶体完整率。取37 ℃生理盐水0.5 mL，加入100 μL精液，10 000 rmin 离心15 s，弃上清；加入0.5 mL多聚甲醛，静置30 min后用PBS离心洗涤2次，使用50 μL PBS重悬后取10 μL样品滴于载玻片上，制成涂片。晾干后用考马斯亮蓝染液滴染涂片，静置30 min。风干后于油镜下观察顶体完整情况，顶体区为紫蓝色的表示顶体完整，顶体区未染色或淡蓝色为顶体不完整[10]。

1.5 统计分析

试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果表示为“平均值±标准误”(Mean±SEM)，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 稀释液的选择

如表2所示，42 ℃解冻17 s时，7号稀释液处理的精子活率(42.97%)最高，5号(39.60%)次之，1号(10.37%)最低，其中7号稀释液处理组与其他各组差异显著。70℃解冻5 s时，7号活率(50.62%)最高，5号(43.47%)次之，1号(17.11%)最低，其中7号稀释液处理组亦为与其他各组差异显著。

42℃解冻17 s处理下，7号稀释液处理组的活力是39.79%，显著高于其他各组；5号和6号次之，二者差异不显著；1号和2号稀释液保存解冻后精子活力最差。70℃解冻5 s处理下，7号稀释液处理组的活力是43.09%，显著高于其他各组；5号(33.47%)次之，1号稀释液处理后精子活力最差(12.06%)。

42 ℃解冻17 s条件下，6号和7号稀释液解冻后精子质膜完整率分别为38.33%和39.39%，显著高于1—5号稀释液。70℃解冻5 s条件下，7号稀释液解冻后精子质膜完整率为40.09%，6号(33.41%)次之，2号(13.07%)最差，其中7号稀释液质膜完整率显著高于其他各组。

在两种解冻条件下，7号稀释液的顶体完整率均最高，分别达53.49%和54.37%，显著高于其他各稀释液组的顶体完整率。1号稀释液的顶体完整率最差，分别为16.33%和15.27%。

表2 不同稀释液处理对精子解冻后性能的影响

注：同列不同字母代表差异显著(P<0.05)

2.2 不同解冻温度-时间的选择

以7号稀释液为冷冻稀释液，比较不同解冻温度和时间对湖羊冻精的影响。如表3所示，不同解冻条件下，70 ℃ 5 s解冻时精子活率和活力分别为50.62%和43.09%，显著高于其他各组。70 ℃ 5 s、42 ℃ 17 s解冻条件下，精子的质膜完整率(分别为40.09%和39.39%)和顶体完整率(分别为54.37%和53.49%)均显著高于其他各组，但两者之间没有显著差异。

表3 不同解冻条件对解冻后精子质量的影响

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

本研究中，7号稀释液无论是从解冻后精子活率活力上，还是从质膜和顶体完整率上，其总体效果均优于其他各组。在精液冷冻过程中，精液稀释液的渗透压和精浆一致，可以避免精子质膜因渗透压变化引起的损伤[11]。精液稀释液的最佳渗透液压范围为300—350 mOsmmL。本试验中7号稀释液的渗透压为317 mOsmmL，处于最佳范围内。

目前稀释液配方中多添加葡萄糖、果糖和蔗糖。葡萄糖为醛糖，是最易被细胞吸收而且最稳定的单糖；果糖为酮糖，与葡萄糖是同分异构体。蔗糖为二糖，由葡萄糖和果糖脱水缩合而成，其化学性质不稳定，在热、冷、酸、碱等环境下会发生改变，化学结构易被破坏[12]。本试验中仅添加蔗糖的1号稀释液效果最差，其次是2号和3号稀释液，4号、5号和6号与7号稀释液相比，效果略差，这可能是由于7号稀释液中添加的葡萄糖，一方面可以保持精子所需渗透压[13]，另一方面可以快速补充精子所需能量，维持细胞代谢所需，使精子存活时间得到延长，受精能力得以提升[14-15]。另外，柠檬酸作为常规稀释液添加物[16]，是pH缓冲物质，本试验中精子解冻后质量明显优于添加二水柠檬酸钠。7号和6号稀释液的冷冻效果优于4号和5号，推测出柠檬酸的最优质量浓度在0.16—0.18gL。

冷冻精子的解冻过程直接影响着冻精的效果，其中解冻时间和解冻温度这两点对于解冻过程来说至关重要[17]。以往日本、法国和英国等国家大部分使用5℃长时间缓慢解冻，澳大利亚、芬兰、比利时、瑞典和新西兰等采用15℃解冻，比利时、匈牙利和前苏联等大部分国家选择37—42℃快速解冻，挪威等少数国家则选择75℃左右高温超快速解冻，包括中国在内的多数国家均采用35—40℃进行精液的解冻[18]。而精液温度在-5—-25 ℃为危险温度带，精液易形成小冰晶，会对精子造成不可逆的物理损伤和化学损伤，而细管快速通过危险温度带能避免损伤[19-20]，同时，由于精液中的酶活性不稳定，解冻时精液中的酶容易凝集精子[21]，本试验采用70℃高温5s解冻时效果最好。宋新华等[22]在牛精子解冻时采用75℃ 高温4s解冻效果最佳，与本试验相似。然而，高温解冻时间较短，需要准确把握解冻时间。

综上所述，7号稀释液处理的精子各项指标(活力、活率、质膜完整率和顶体完整率)在不同解冻温度下均最高。本研究中使用7号稀释液进行冷冻，解冻时采用70 ℃解冻5 s效率最佳。