降脂舒心合剂HPLC指纹图谱的建立及制剂安全性项目的影响因素检测

刘敏 范蕾 陈桂云 余乐 冯美玲

[摘要] 目的 完善降脂舒心合剂的质量控制标准。 方法 以Waters XB C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇为流动相A，以混合水溶液（含磷酸为0.6%和四氢呋喃0.2%）为流动相B。梯度洗脱：0～15 min，2% A;15～55 min，2%～25% A;55～90 min，25%～40% A;90～110 min，40%～50% A。检测波长为280 nm，柱温30℃，流速为1.0 mL/mim，分析时间为120 min，进样量为10 μL。采用上述方法建立降脂舒心合剂的指纹图谱。采用高效液相色谱法对该制剂中防腐剂的含量进行测定。采用电感耦合等离子质谱法对其可能含有的重金属及有害元素进行检测。 结果 10批样品相似度均符合要求;苯甲酸含量均<0.3%。样品铅、镉、铬、砷、镍、铜、汞含量均符合《美国药典》新通则<232>的规定。 结论 本研究建立的指纹图谱简便、重复性好，为降脂舒心合剂的综合质量评价提供了科学依据;建议增加影响制剂安全性的项目，以便严格控制制剂质量。

[关键词] 降脂舒心合剂;指纹图谱;防腐剂;重金属及有害元素

[中图分类号] R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0117-06

[Abstract] Objective To improve the quality control standard of Jiangzhi Shuxin Mixture. Methods Waters XB C18 （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the mobile phase， and methanol was used as mobile phase A. The mixed aqueous solution （containing 0.6% phosphoric acid and 0.2% tetrahydrofuran） was used as mobile phase B. Gradient elution： 0-15 min， 2% A; 15-55 min， 2%-25% A; 55-90 min， 25%-40% A; 90-110 min， 40%-50% A. The detection wavelength was 280 nm， the column temperature was 30℃， the flow rate was 1.0 mL/mim， the analysis time was 120 min， and the injection volume was 10 μL. The above method was used to establish a fingerprint for Jiangzhi Shuxin Mixture. The content of the preservative in the preparation was determined by high performance liquid chromatography. Inductively coupled plasma mass spectrometry is used to detect heavy metals and harmful elements that may be contained. Results The similarity of 10 batches of samples met the requirements. The contents of benzoic acid were less than 0.3%. The contents of lead， cadmium， chromium， arsenic， nickel， copper and mercury in the samples all conform to the new general rule <232> of the American Pharmacopoeia. Conclusion The fingerprint established in this study is simple， reproducible and provides a scientific basis for the comprehensive quality evaluation of Jiangzhi Shuxin Mixture. It is suggested that more items affecting the safety of the preparation should be added in order to strictly control the quality of the preparation.

[Key words] Jiangzhi Shuxin Mixture; Fingerprint; Antiseptic; Heavy metals and harmful elements

降脂舒心合剂是由延胡索、姜黄、丹参、当归、莪术、地黄、降香、何首乌、山楂、虎杖、银杏叶、荷叶共十二味中药配伍制备而成的医院制剂，具活血化瘀的功效。临床用于血瘀症引起的头晕、心悸、胸闷等症。目前该制剂的执行标准为2005年版《浙江省医疗机构制剂规范》[1]，其检验项目仅限于延胡索乙素的薄层鉴别、pH值、相对密度检查等常规检验项目。上述标准仅收载了延胡索的薄层色谱鉴别方法，未对组方中其他药材进行监控，也无影响制剂安全性的检查项目。本研究采用高效液相色谱法建立降脂舒心合剂的指纹图谱，并對主要的色谱峰进行了归属性研究，揭示了制剂的起效物质基础。根据2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称“《中国药典》”）通则[2]要求，建立了制剂中防腐剂苯甲酸钠的高效液相含量测定方法。此外，基于镉、铅、砷、汞等重金属对人体的危害性[3-4]，本研究参照2015年版《中国药典》通则[2]项下方法对其可能含有的重金属及有害元素含量进行了检测。本研究建立的上述3个方法能科学、全面、有效地控制制剂质量，建议修订并纳入降脂舒心合剂的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200、1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）;XS105DU电子天平（梅特勒，d=0.01 mg/ 0.1 mg）;Agilent 7900型电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）;Mlli-Q Advantage A10超纯水系统（美国MERCK MLLIPORE）;CEM MARSXPERSS微波消解仪（美国CEM公司）。

1.2 试药

原儿茶醛对照品（生产批号：110810-201007，含量为98.2%）;丹参素钠对照品（生产批号：110855-200809，含量为100.0%）;虎杖苷对照品（生产批号：111575-200301，含量为100.0%）;2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品（生产批号：110844-201713，含量为93.6%）;异槲皮苷对照品（生产批号：111809-201403，含量为92.9%）;丹酚酸B对照品（生产批号：111562-201009，含量为96.0%）;苯甲酸钠对照品（生产批号：100433-200301，含量为100.0%）;5-羟甲基糠醛对照品（生产批号：111626-201308，含量为98.3%）;丹参对照药材（生产批号：120923-201414）;荷叶对照药材（生产批号：121322-200402）;虎杖对照药材（生产批号：120980-200804）;何首乌对照药材（生产批号：120934-200507）;山楂对照药材（生产批号：121626-201402）;地黄对照药材（生产批号：121180-200402）;上述对照品、对照药材均购自中国食品药品检定研究院。

铬标准液（生產批号：15082，1000 μg/mL）;镍标准液（生产批号：16041，100 μg/mL）;铜标准液（生产批号：16103，1000 μg/mL）;砷标准液（生产批号：16052， 1000 μg/mL）;铅标准液（生产批号：16064，1000 μg/mL）;镉标准液（生产批号：16074，1000 μg/mL）;汞单元素标准溶液（生产批号：16084，1000 μg/mL），上述标准物质溶液均购自中国计量科学研究院。铋单元素标准物质溶液（生产批号：171007-2，1000 μg/mL）;锗单元素标准物质溶液（生产批号：171015，1000 μg/mL）;铟单元素标准物质溶液（生产批号：171005，1000 μg/mL）;金单元素标准物质溶液（生产批号：16A007-2，1000 μg/mL），上述标准物质溶液均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。

浓硝酸为优级纯，甲醇、磷酸、四氢呋喃为色谱纯;乙酸铵为分析纯;超纯水经Mlli-Q超纯水系统自制而得。

降脂舒心合剂（由浙江省丽水市中医院提供，批号分别为20151009、20160126、20160527、20160729、20160927、20170224、20170630、20170901、20171027、20180001）。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件  色谱柱：Waters XB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。以甲醇为流动相A，以混合水溶液（含磷酸为0.6%和四氢呋喃0.2%）为流动相B，梯度洗脱：0～15 min，2%A;15～55 min，2%～25%A;55～90 min，25%～40%A;90～110 min，40%～50%A。检测波长为280 nm，柱温30℃，流速为1.0 mL/mim，分析时间为120 min，进样量为10 μL。

2.1.2 供试品溶液的制备  精密量取样品5 mL置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 对照溶液的制备  分别精密称取对照品适量，置于同一量瓶中，以50%甲醇为溶剂制成含丹参素钠40.2 μg/mL、原儿茶醛13.6 μg/mL、虎杖苷27.7 μg/mL、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷27.9 μg/mL、异槲皮苷46.5 μg/mL、丹酚酸B 33.3 μg/mL的混合对照品溶液;另以水为溶剂配制成含苯甲酸钠87.696 μg/mL对照品溶液，以甲醇为溶剂配制成含5-羟甲基糠醛200.0 μg/mL对照品溶液（因苯甲酸钠对照品紧缺，故用防腐剂含量测定项下对照品进行定位，5-羟甲基糠醛稳定性差，故单独配制配制进行定位）。

2.1.4 方法学考察  取同一批降脂舒心合剂（生产批号：20160927）进行精密度、重复性、稳定性试验。色谱图中单峰面积占总峰面积大于3%的共有指纹峰共有10个，以分离度较好、保留时间适中的虎杖苷为参照。

精密度试验：相对保留时间的RSD范围为0.02%～1.65%，相对峰面积的RSD范围为0.53%～2.47%。

重复性试验：相对保留时间的RSD范围为0.01%～0.94%，相对峰面积的RSD范围为1.42%～2.95%。

稳定性试验：在24 h内，相对保留时间的RSD为0.07%～1.56%，相对峰面积的RSD为0.81%～2.48%。方法学实验结果符合要求。

2.1.5 相似度评价  采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.0版）对10批样品进行评价，以S1为参照图谱，生成色谱的方法为平均值，选择时间宽度0.5，生成对照指纹图谱R，确定了18个共有峰，各批样品与对照指纹图谱比较相似度值范围为0.977～0.992。

2.1.6 专属性考察  分别称取丹参、荷叶、何首乌、虎杖、山楂、地黄对照药材各1 g加适量水煎煮30 min，浓缩至40 mL，制成对照药材溶液。精密吸取上述对照药材各5 μL，分别进样，记录色谱图。依据所得图谱，通过光二极管阵列检测器确定10个主要药材成分峰的归属：9、11、17号峰归属于丹参药材，13、18号峰归属于虎杖药材，6、15号峰归属于何首乌药材，5、16号峰归属于荷叶药材，3号峰归属于生地，7号峰在地黄及山楂药材中均有检出，并且此类成分在药材煎煮过程中也容易生成，故无法确定其归属。通过查阅相关文献[5-18]，进行主要成分的确证，确定了8个化学成分。主要色谱峰的相对保留时间及鉴定结果见表1。