紫杉醇对人鼻咽癌细胞体外自噬的影响

师小径 郑明奋 万仁强 张沈华

[摘要] 目的 探討紫杉醇对人鼻咽癌细胞体外自噬的影响。 方法 体外培养人鼻咽癌细胞系CNE2，采用MTT法检测紫杉醇对人鼻咽癌细胞系CEN2的增殖抑制，分析紫杉醇对CEN2细胞凋亡的影响;观察并分析药物作用后鼻咽癌细胞周期变化及紫杉醇对CNE2细胞的放射增敏作用。 结果 加药12 h后，存活细胞比例明显低于对照组（P < 0.05）;加药48 h后，存活细胞比例明显低于其他组（P < 0.05）;加药24 h后，早期凋亡细胞比例最高，明显高于其他组（P < 0.05）;加药48 h后，细胞坏死和晚期凋亡细胞比例最高，明显高于其他组（P < 0.05）。在整个细胞周期中，空白对照组G0/G1周期占比最高，同时明显高于其他组（P < 0.05）;单纯紫杉醇组G2/M周期占比最高，同时明显高于其他组（P < 0.05）;单纯放疗组G0/G1、G2/M和S周期的占比比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;紫杉醇+放疗组G2/M周期占比例最高（P < 0.05）。其中紫杉醇+放疗组的细胞凋亡率明显高于其他组（P < 0.05）。 结论 紫杉醇对人鼻咽癌CNE2细胞有明显的毒性作用，能抑制人鼻咽癌CNE2细胞的分裂，可一定程度上治疗鼻咽癌。随着紫杉醇浓度的增加，其对CNE2细胞的凋亡作用越强。紫杉醇联合放疗治疗可进一步提高CNE2细胞的凋亡率。

[关键词] 紫杉醇;鼻咽癌;细胞自噬

[中图分类号] R739.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（c）-0022-04

ct] Objective To investigate the effect of Paclitaxel on autophagy in human nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Methods Human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 was cultured in vitro. The proliferation inhibition of Paclitaxel on human nasopharyngeal carcinoma cell line CEN2 was detected by MTT assay. The effect of Paclitaxel on CEN2 cell apoptosis was analyzed. The cell cycle changes and radiosensitization of Paclitaxel on CNE2 cell were observed and analyzed. Results After 12 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of the control group （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of surviving cells was significantly lower than that of other groups （P < 0.05）; after 24 h of treatment， the proportion of early apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）; after 48 h of treatment， the proportion of cell necrosis and late apoptotic cells was the highest， significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. In the whole cell cycle， the proportion of G0/G1 cycle in blank control group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; the proportion of G2/M cycle in paclitaxel group was the highest， and significantly higher than that in other groups （P < 0.05）; there was no significant difference in the proportion of G0/G1， G2/M and S cycle in radiotherapy group （P > 0.05）; and the proportion of G2/M cycle in paclitaxel + radiotherapy group was the highest （P <0.05）. The apoptotic rate of paclitaxel + radiotherapy group was significantly higher than that of other groups （P < 0.05）. Conclusion Paclitaxel has obvious toxic effects on human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， which can inhibit the division of human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and can treat nasopharyngeal carcinoma to some extent. As the concentration of paclitaxel increases， its apoptosis effect on CNE2 cells is stronger. Paclitaxel combined with radiotherapy can further increase the apoptosis rate of CNE2 cells.

[Key words] Paclitaxel; Nasopharyngeal carcinoma; Cell autophagy

放化疗联合治疗是临床治疗头面部肿瘤的主要方式之一，能降低肿瘤复发和转移率，提高患者的生活质量水平[1]。但其对肿瘤患者的生存率并无明显改善。肿瘤是否发生转移是影响肿瘤患者生存期的重要因素[2]，如何有效局部控制肿瘤一直广受临床医师重视和关注。化疗具有增敏放射治疗的作用，药物化疗增加了放疗的敏感性，增强了放疗治疗效果[3]。如今临床上化疗药物较多，包括5-氟尿嘧啶、顺铂、羟基脲、阿霉素等，均能有效提高放疗的效果[4]。虽然放射治疗提高了化疗药物治疗对肿瘤细胞的杀伤力，但正常细胞也会受到相应的损伤[5]。鼻咽癌在临床上较为常见，一般多采用放疗进行治疗。大多数放化疗主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤进一步发展。近年来，细胞自噬在肿瘤治疗方面发挥出积极作用。自噬是细胞降解细胞器的唯一途径，是肿瘤细胞生存所必需的过程。但在某些情况下，持续、过度自噬可导致肿瘤细胞死亡，实现灭杀肿瘤细胞的效果[6]。紫杉醇是临床常用的化疗药物，具有广泛的抗癌谱。本研究通过探讨紫杉醇对人鼻咽癌CNE2细胞体外自噬的影响，以期为临床化疗联合放疗鼻咽癌提供理论依据，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

所有鼻咽癌CNE2细胞均由中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉头颈外科提供。

1.2 仪器与试药

1.2.1仪器  高速低温离心机（美国BeckmanGS-15R公司）;流式细胞仪（BD）（日本Shmadzu公司）。

1.2.2 试剂  紫杉醇（法国Sanofi-Aventis公司）;胎牛血清（美国GIBCO公司）;胰酶（美国Sigma公司）。

1.3 试剂配制

1.3.1 RPMI-1640培养液  取1640干粉型培养基置于恰当容器，三蒸水溶解，加入1.6 g NaHCO3干粉以及2.38 g HEPES干粉。将所配制的试剂放于离心机上进行充分搅拌，时间30 min，以保证培养基中的干粉溶解完全。将预先配制好的盐酸溶液缓慢滴入培养液中，搅匀，使pH值调整为7.2～7.4，定容1000 mL，微孔滤过膜滤菌，微孔直径0.22 μm。加入胎牛血清配置成10%胎牛血清培养液，备用。

1.3.2 PBS缓冲液  在烧杯中分别加入0.2、0.2、2.9、8.0 g的KCl、KH2PO4、NaH2PO4、NaCl，加入三蒸水至1000 mL，将pH值调至7.2，高压灭菌并在4℃冰箱中保存备用。

1.3.3 0.25%胰蛋白酶溶液  将0.25 g胰蛋白酶加入100 mL三蒸水溶解，pH调至7.0，4℃过夜，次日滤菌，配制成0.25%胰蛋白酶溶液。

1.3.4 冻存液  取PRMI-1640培养液7 mL、胎牛血清2 mL以及DMSO 1 mL混合，4℃保存备用。

1.3.5 MTT溶液  25 mg MTT干粉加入磷酸缓冲盐（PBS）溶液5 mL，充分搅拌30 min，4℃保存。提取保存在液氮罐中的CNE2细胞，37℃水浴解冻并吸出悬浮细胞，将10 mL PRMI-1640溶液加入装有细胞悬液的离心管中。1000 r/min离心5 min，去除上清液，漂洗离心培养基后，加入培养液，使培养液覆盖瓶底，37℃下进行培养。当细胞生长至覆盖瓶底70%时可传代。PBS洗涤两次，加入0.2 mL胰酶，显微镜下若观察到细胞固缩，则立刻停止消化，加入3 mL培养液，敲打时瓶底细胞脱落。分装细胞悬液，加入培养液至5 mL，放入培养箱中培养。

1.3.6 紫杉醇培养基  逐步稀释含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基至各浓度。

1.4 MTT法检测紫杉醇对CNE2细胞的毒性作用及IC50

①取对数期生长的CEN2細胞，制备单细胞悬液1×105/mL;②取96孔板，分别加入200 μL单细胞悬液进行培养;③CEN2细胞贴壁后分别加入不同浓度的紫杉醇培养液，浓度分别为0.015、0.06、0.25、1、4、16、64 μg/mL。每个浓度均设置6个复孔，同时设立对照组，对照组加入生理盐水作为对照;④其后，37℃恒温箱中培养48 h，去除陈旧培养基及药物;⑤每孔加入20 μL MTT溶液，再次孵育4 h;⑥去除MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，振荡10 min;⑦在490 nm处采用酶标仪测量OD值;⑧根据所测OD值计算紫杉醇对CEN2细胞的抑制率和IC50。

1.5 流式细胞仪检测不同紫杉醇浓度及作用不同时间对CNE2细胞凋亡的影响

1.5.1 AnnexinV/PI双杂流式细胞术检测紫杉醇对CNE2细胞的诱导凋亡作用  ①于6孔板中种植CNE2细胞，分为加药12 h组、加药24 h组、加药48 h组，待细胞贴壁后加入4 μg/mL紫杉醇;②于加入紫杉醇12、24、48 h后收集细胞并制成单细胞悬液，1000 r/min旋转离心5 min，后弃上层血清。PBS溶液洗涤3次;③将细胞重悬，加入200 μL缓冲液，细胞密度调至1×106个/mL;④取195 μL细胞悬液加至AnnexinV-FITC溶液5 μL混匀，避光放置10 min;⑤结合缓冲液进行清洗，采用离心机，1000 r/min旋转离心5 min，后弃去上清液，重新悬浮于190 μL配好的缓冲液中;⑥加入10 mL PI（20 μg/mL），室温下避光孵育5 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5.2 紫杉醇对CNE2细胞凋亡率和周期的影响  ①细胞分组：将CNE2细胞分为空白对照组、单纯紫杉醇组、单纯放疗组以及紫杉醇+放疗组（放疗方法：鼻咽部治疗采用6 mV光子线照射，剂量72～76 Gy，照射36～38次，治疗8周。）;②接种CNE2细胞于6孔板上，等待细胞贴壁;③待CNE2细胞贴壁后将细胞悬浮、消化、洗涤、离心;④采用70%乙醇固定，-20℃保存;⑤再取1×106个细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，3 mL PBS悬浮细胞;⑥400目筛网过滤，1000 r/min离心5 min，弃除PBS;⑦加入PI染液和RNA酶各1 mL，4℃下避光反应30 min;⑧流式细胞仪检测。

1.6 观察指标

所有实验步骤重复3次，取平均值，观察紫杉醇作用不同时间对CNE2细胞的影响以及紫杉醇和放疗对CNE2细胞周期分布的影响。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇作用不同时间对CNE2细胞的影响

加药12 h和加药24 h后存活细胞明显低于对照组，加药48 h后存活细胞比例明显低于其他组（均P < 0.05）;加药24 h早期凋亡细胞比例最高，明显高于其他组（P < 0.05）;加药48 h细胞坏死和晚期凋亡细胞比例最高，明显高于其他组（P < 0.05）。见表1。

2.2 紫杉醇和放疗对CNE2细胞周期分布的影响

在整个周期中，空白对照组G0/G1周期的占比最高，同时明显高于其他组（P < 0.05）。单纯紫杉醇组G2/M周期占比最高，同时明显高于其他组（P < 0.05）。单纯放疗组G0/G1、G2/M和S周期的占比比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。紫杉醇+放疗组G2/M周期占比最高（P < 0.05）。其中，紫杉醇+放疗组凋亡率明显高于其他组（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

鼻咽癌在临床上较为常见，临床主要采用放疗法进行治疗，放疗联合化疗是临床治疗鼻咽癌的标准方案[7]。虽然放疗技术和设备在不断进步，但鼻咽癌患者预后生存率仍然不高[8]。

近年来，随着紫杉醇在临床上的广泛应用，其对各种恶性肿瘤的放化疗起到了促进作用[9]。报道[10]显示，紫杉醇联合顺铂以及5-氟尿嘧啶进行化疗，其化疗效果相对于顺铂联合5-氟尿嘧啶更显著，且细胞毒性反而更低。而其他研究[11]中也报道，紫杉醇在治疗鼻咽癌中具有良好效果。

紫杉醇是一种植物类抗癌药，由太平洋紫杉树的树皮和针叶中提取而出，具有抗癌作用[12]。其作用与细胞骨架的维管系统，通过与β-微管蛋白氨基酸的结合，促进微管蛋白的结构稳定性，阻断细胞周期G2/M期干扰细胞分裂，从而促进放疗效果[13-14]。本研究采用紫杉醇对人鼻咽癌CNE2细胞进行处理，观察不同浓度紫杉醇以及紫杉醇和放疗对鼻咽癌CNE2细胞的影响。结果显示，紫杉醇浓度越高，存活细胞比例越低，而坏死和晚期凋亡细胞比例明显升高。提示紫杉醇具有较强的细胞毒性，其浓度升高时，紫杉醇对CEN2细胞具有较强的杀伤作用。紫杉醇作用12 h，即出现了细胞凋亡现象;紫杉醇作用24 h，早期凋亡最明显;紫杉醇作用48 h，早期凋亡降低，但CNE2大量坏死和晚期凋亡，可见紫杉醇对CNE2细胞具有明显抑制作用，早期主要为细胞凋亡，晚期为细胞坏死。细胞凋亡与肿瘤发生发展息息相关[15]。目前认为可能引起肿瘤的原因[16]为：①可诱导凋亡细胞基因的失活，导致凋亡基因表达水平较高;②机体免疫导致肿瘤细胞凋亡功能丧失;③宿主细胞抑制肿瘤细胞凋亡。而紫杉醇引起鼻咽癌CNE2细胞凋亡的机制可能与紫杉醇影响细胞内各蛋白的表达有关。王娜等[17]的研究显示，Bcl-2、Bax、Cox-2、Cyclin-D1及Caspase-3等基因表达水平与肿瘤细胞凋亡功能有密切关系。

还有研究[18]显示，紫杉醇对肿瘤放疗具有增敏作用，但目前紫杉醇对肿瘤放疗的增敏作用机制尚未完全明确。部分学者[19]认为这可能与紫杉醇抑制了放疗后引起的细胞潜在性致死损伤修复功能有关。大部分学者更偏向与细胞不同周期对射线敏感性不同的理论[20]。在细胞周期中以G2/M期为最敏感的时期，S期为最不敏感期。通常认为将细胞滞留与G2/M期是放疗效果最好的时期。本研究发现，单纯紫杉醇作用的CNE2细胞停留在G2/M期的比例高达80%，提示紫杉醇具有浆细胞阻滞在G2/M期的作用，从而增加细胞对射线的敏感程度，提高放疗效果。紫杉醇联合放疗治疗后，细胞凋亡率高达55.62%，明显高于其他组，也进一步提示紫杉醇对放疗具有增敏作用，提高了放疗对CNE2细胞的杀伤力，从而达到杀灭肿瘤细胞的效果。

综上所述，紫杉醇对人鼻咽癌CNE2细胞具有明显的细胞毒性作用和抑制分裂效果，可一定程度上起到治疗鼻咽癌的作用。随着紫杉醇浓度的增加，其对CNE2细胞的凋亡作用越强。紫杉醇联合放疗治疗可进一步提高CNE2细胞的凋亡率。

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（收稿日期：2018-02-09  本文编辑：王   蕾）