miRNA-155通过AT1R-VEGFR2通路影响大鼠脑梗死后血管生成的研究

魏欣 纳文丽 白向东 胡雯 马玲

【摘 要】目的：探讨miRNA-155通过AT1R/VEGFR2信号通路调控大鼠脑梗死后血管生成的作用及机制。方法：选择雌性SD大鼠采用大脑中动脉线栓闭塞的方法建立大鼠脑缺血实验动物模型。将大鼠分为四组，分别为假手术组、脑缺血组、脑缺血/ miRNA-155模拟物组、脑缺血/miRNA-155 抑制物组。RT-PCR检测各组大鼠脑梗死后miRNA-155表达量;Zea-Longa 5 分制评分法对各组大鼠进行神经功能评分;采用2，3，5 -三苯基四唑氯铵染色法评价各组大鼠脑梗死体积;免疫组织化学染色法检测各组大鼠缺血脑皮质区CD31蛋白的表达量;Western blotting 检测各组大鼠缺血脑皮质区VEGFR2和AT1R的表达。结果：脑梗死后脑缺血组织中miRNA-155表达增加。假手术组大鼠无神经功能损害症状，而脑缺血组大鼠有明显的神经功能损害。经miRNA-155抑制剂治疗后，脑缺血大鼠神经功能得到改善，脑梗死面积减少。但经miRNA-155模拟治疗后，神经功能进一步恶化，脑梗死面积增加。免疫组化检测结果表明，miRNA-155抑制剂可上调CD31的表达，而miRNA-155模拟物可下调CD31的表达。Western blotting检测发现，经miRNA-155抑制剂处理后，脑缺血大鼠AT1R和VEGFR2蛋白表达增加;但经miRNA-155模拟处理后，AT1R和VEGFR2 蛋白表达降低。结论：抑制miRNA-155可以改善脑梗死大鼠的神经功能损害，减少脑梗死体积，有效促进缺血区血管生成，这可能是通过AT1R/VEGFR2信号通路介导的。

【关键词】miRNA-155;脑梗死;血管生成;血管内皮生长因子;血管紧张素II受体1

【中图分类号】 R733 .7

【文献标识码】 A  【文章编号】 1672-3783（2019）04-03-248-01

流行病学调查结果显示，我国脑梗死发病率呈逐年上升趋势，因其致残率高、死亡率高而受到广泛关注[1]。脑梗死可引起脑神经元的不可逆变性和坏死，从而导致一系列神经功能障碍。因此寻求早期促进脑梗死区域局部血管生成的有效手段，恢复组织灌注对脑梗死患者预后具有重要意义。

血管生成可以改善脑梗死区域的灌注，从而促进中枢神经的再生，是脑神经元恢复的基础[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是血管生成过程中最重要的调节因子之一。VEGF通过VEGF受体1、2、3三种受体发挥作用，其中VEGFR2对早期血管生成最为重要[3]。血管紧张素II（Angiotensin II， Ang II）是一种多功能的生物活性肽，能促进血管生成，在血管生成中起着关键作用。血管紧张素II受体1 （AT1R）/VEGFR2信号通路可促进血管内皮细胞的增殖和迁移，在生理和病理条件下均可调控血管生成[4]。因此有必要寻求有效的措施来增强AT1R/VEGFR2通路在这一过程中的作用。

miRNA是一种小的非编码RNA分子，约有22个核苷酸，广泛存在于植物、动物和一些病毒中[5]。基于靶基因与信使RNA（mRNA）的互补配对，miRNA在RNA沉默和转录后可以在基因调控中发挥关键作用。据报道miRNA-155与血管生成有着密切的关系，其靶基因为AT1R，可以靶向降低AT1R的表达，抑制Ang II/AT1R信号通路，从而导致血管生成抑]。研究发现在脑缺血状态下miRNA-155的表达显著增加，而抑制miRNA-155可以保护神经，从而改善脑缺血的损伤[6]。因此本研究拟建立大鼠脑梗死模型，根据miRNA-155在体内的过表达及对表达的抑制作用，观察miRNA-155对脑梗死大鼠血管生成的影响，进一步探讨AT1R/VEGFR2通路在这一过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性SD大鼠，体重200-250g，购于兰州大学基础医学院。

1.2 试剂

RNA提取试剂盒购于美国Invitrogen公司;反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购于日本Takara公司;miRNA-155模拟物、miRNA-155抑制剂购于美国Life Technologies公司;2，3，5 -三苯基四唑氯铵购于美国Sigma公司;兔抗大鼠CD31、AT1R、VEGFR2、β-actin antibody抗体购于美国Santa Cruz公司;辣根过氧化物没标记的羊抗兔IgG购于中国北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 设备

電子分析天平购于瑞士梅特勒托利多公司;台式离心机购于美国BECKMAN公司;实时荧光定量PCR仪、稳压稳流电泳仪、Mini Trans-blot转移系统购于美国Bio-Rad公司。

1.4 SD大鼠脑缺血实验动物模型的构建

采用大脑中动脉线栓闭塞（MCAO）的方法建立大鼠脑缺血实验动物模型：经颈外侧切口，从颈总动脉分叉处附近插入线栓，制作大脑中动脉闭塞缺血性脑卒中的大鼠实验动物模型。

1.5 分组和干预

将大鼠分为四组，每组10只。第一组为假手术组，不阻断右侧大脑中动脉，假手术5分钟后经侧脑室注射等容量生理盐水。第二组为大脑中动脉线栓闭塞模型组，本组于脑缺血5分钟后经侧脑室注射等容量生理盐水。第三组为脑缺血/模拟物组，于脑缺血5分钟后经侧脑室注射miRNA-155模拟物10ug。第四组为脑缺血/miRNA-155 抑制物组，于脑缺血5分钟后经侧脑室注射 miRNA-155 抑制物10ug。

1.6 神经功能评分

参照 Zea-Longa 5 分制评分标准，于缺血24小时对各组大鼠进行行为学评分纪录[7]。

1.7 梗死体积测定

过量麻醉处死，迅速断头取脑，将鼠脑立即置于-20℃冰箱中20min后取出，行2mm厚的连续冠状切片。将切片立即置于2%氯化三苯四氮唑溶液中，37℃恒温下避光染色30 min，然后置于4℃、4%多聚甲醛溶液中固定24h。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色，测定每张脑片的梗死面积。

1.8 RT-PCR检测 miRNA-155的表达

采用RNA提取试剂盒提取总RNA，设计miR-155上游引物： 50-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGG-30，下游引物：TATTCGCACTGGATACGACCCCCTA，采用RT-PCR试剂盒将RNA反转录成cDNA，统计各组间miRNA-155相对表达量。

1.9 免疫组织化学染色法检测缺血脑皮质区CD31的表达

取各组大鼠缺血区的脑组织，4%多聚甲醛固定。洗涤后依次乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋切片、脱蜡水合、修复抗原，内源性过氧化物酶阻断。血清封闭后加入抗CD31一抗，4℃孵育过夜。洗涤后加入生物素标记的IgG孵育10min。洗涤后加入链霉菌素亲和素过氧化物酶，室温孵育10 min。DAB染色3 min，苏木精染色10 s。1%盐酸乙醇分化2 s。用中性树脂固定后，在显微镜下观察。

1.10 Western blotting 检测VEGF受体2（VEGFR2）和AT1R的表达

提取脑组织蛋白用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后蛋白转膜，将转移后的膜取出，用50ml的TBS室温晃动洗涤5分钟。将膜置于50ml 5%脱脂牛奶的TBS中室温晃动封闭1小时。25ml的TBS洗涤三次，每次洗涤5分钟。加入稀释好的VEGF受体2（VEGFR2）和AT1R的兔抗大鼠一抗，β-actin兔抗人一抗为1：3000倍稀释，室温孵育2小时。25ml的TBS洗涤三次，每次洗涤5分钟。加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2小时。25ml的TBS洗涤三次，每次洗涤5分钟，显色并分析系统进行分析。

1.11 统计学分析

所有数据均采用SPSS 19.0进行处理。测量数据用均数±标准差表示。方差齐性检验采用Levene检验（参考标准为0.10）。符合方差齐性的采用单向ANOVA和LDS检验，不符合方差齐性的采用Kruskal-Wallis H检验。采用配对t检验对同一组实验前后进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分和梗死体积比较

假手术组大鼠无神经功能损害症状，而脑缺血组大鼠神经功能损害评分为2.698±0.529。经miRNA-155抑制剂治疗后，与脑缺血组相比，神经功能损害评分降低（P < 0.05），而miRNA-155模拟物治疗后，神经功能损害评分升高（P < 0.05）。2，3，5 -三苯基四唑氯铵染色结果显示，miRNA-155抑制剂治疗后脑梗死面积减小（P < 0.05），而miRNA-155模拟物治疗后脑梗死面积增大（P < 0.05）。以上结果表明，抑制miRNA-155可改善脑梗死患者的神经功能，减少脑梗死体积宏观。具体见表1所示。

2.2 各组大鼠miRNA-155表达的变化

脑梗死后检测脑缺血组织中miRNA-155的表达，各组大鼠miRNA-155相对表达量见表2所示。比较显示脑缺血组大鼠miRNA-155的表达量显著高于假手术组。脑缺血/ miRNA-155模拟物组和脑缺血/ miRNA-155抑制剂组与脑缺血组相比较，结果显示与脑缺血组相比，脑缺血/ miRNA-155模拟物组miRNA-155表达显著增加（P < 0.01），而脑缺血/ miRNA-155抑制剂组miRNA-155表达显著降低（P < 0.01）。miRNA-155模拟物可以模拟内源性的miRNA-155，从而上调miRNA-155的表达增强其功能。miRNA-155抑制剂可以特异性地靶向敲除miRNA-155，从而下调miRNA-155的表达。

2.3 miRNA-155对脑梗死后缺血组织CD31表达的影响

本研究采用免疫组织化学方法进一步检测脑梗死后缺血组织中CD31的表达情况。结果显示与假手术组相比，脑缺血组大鼠缺血组织中CD31表达无明显变化（P > 0.05）。经miRNA-155抑制剂处理后，CD31表达显著升高（P < 0.01）;而经过miRNA-155模拟物处理后，CD31表达显著降低（P < 0.01），说明抑制miRNA-155可促进脑梗死后血管生成。见表3所示。

2.4 miRNA-155对脑梗死后缺血组织中AT1R和VEGFR2蛋白表达的影响

本研究用Western blotting检测脑梗死后缺血组织中AT1R和VEGFR2蛋白表达。miRNA-155抑制剂处理后AT1R和VEGFR2蛋白的表达明显增加（P < 0.01），而经过miRNA-155模拟物处理后，AT1R的表达和VEGFR2蛋白显著减少（P < 0.01）。表明抑制miRNA-155的表达可以促进脑梗死后血管生成，可能是通过AT1R / VEGFR2通路介导的。见表4所示。

3 讨论

脑血管疾病已成为人类死亡的重要原因之一，其中缺血性脑血管疾病占绝大多数，约占死亡总数的75%-85%。脑梗死可引起脑神经元的不可逆变性和坏死，从而导致一系列神经功能障碍，给患者及其家属和社会带来巨大的负担[8]。

本研究中脑梗死后脑缺血组之中miRNA-155的表达量显著增加，这表明脑缺血后miRNA-155的表达参与脑组织的损伤。为了明确miRNA-155在脑梗死后脑组织损伤中的作用，我们利用miRNA模拟物上调了miRNA的表达，并利用miRNA抑制剂下调了miRNA的表达。结果表明，miRNA-155抑制剂能改善脑缺血大鼠的神经功能，减少脑梗死体积;而miRNA-155的模拟会进一步恶化脑缺血大鼠的神经功能，增加脑梗死的体积。

参考文献

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[3]Silpanisong J， Pearce WJ. Vasotrophic regulation of age-dependent hypoxic cerebrovascular remodeling. Curr Vasc Pharmacol 2013; 11（5）： 544-563.

[4]张荻，徐鸣曙，张英杰，程爱芳，管华宗.脑缺血后周细胞及相关血管生成信号通路的研究进展[J].中国康复理论与实践：1-6

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