火麻叶中大麻二酚的热回流法提取工艺研究

高 哲，张志军，李晓君，李会珍

(中北大学 化学工程与技术学院，太原 030051)

火麻(CannabissativaL.)最早源于中亚，又名大麻、汉麻、线麻，是一年生草本植物，其茎皮纤维长而坚韧，可用作织麻布、制绳索和造纸等；其种子含油量达30%，油中富含多不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸、γ-亚麻酸、亚油酸总含量达76%～82%，高于其他常见油脂，具有极高的营养价值。火麻作为纤维、食物的来源已经有3 000多年的历史[1]。火麻叶中有多种大麻素类化合物，主要是大麻二酚及其羧基化合物。大麻二酚是非成瘾性成分，具有阻断某些多酚对人体神经系统的不利影响，并且具有治疗糖尿病、阻断乳腺癌转移、抗痉挛、抗类风湿关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能[2-5]。近年来，科学家们也将大麻二酚应用于临床试验从而更好地研究其抑菌、抗炎、抗癌等活性，为人类健康发展提供有效保障[7-13]。因此，大麻二酚的提取制备得到广泛重视。

目前大麻二酚提取工艺主要为酶辅助溶剂法[1]、超声辅助溶剂法[2，12]及超临界CO2萃取法[13]。本试验选用既适合实验室又广泛应用于规模化工业生产中的热回流法[14]，先确定最优提取溶剂再通过单因素试验和正交试验确定火麻叶中大麻二酚提取的最佳工艺条件，同时建立气相色谱-质谱法(GC-MS)对浸膏中的大麻二酚进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

火麻叶：榆社县田禾绿色食品有限公司；大麻二酚标准品：国家食品药品检定所；正己烷、石油醚、无水乙醇(分析纯)；甲醇(色谱级)。

1.1.2 仪器与设备

FA1204B分析天平：上海精科天美科学仪器有限公司；JM-B-2002电子天平：余姚市纪铭称重设备有限公司；BJ-400型高速多功能粉碎机：北京普朗新技术科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海知信实验仪器技术有限公司；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SB-5200超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；TRACE1300/ISQ气质联用仪：Thermo Fisher。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5毛细管柱(30 m×0.2 mm×0.11 μm)；载气为氦气，流速1.5 mL/min；柱温程序为起始温度120℃，保持1 min，以4℃/min升温至160℃，以13℃/min升温至275℃，保持3 min；进样口温度230℃；检测器接口温度280℃；分流比5∶1；进样量1 μL。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源，离子源温度230℃；四级杆温度150℃；质谱TIC模式；扫描范围(m/z)200～500；溶剂延迟时间3 min。

称取0.010 0 g大麻二酚标准品，以甲醇定容制成母液(1 mg/mL)，分别取50、100、150、200、250、300 μL，均放置于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为5、10、15、20、25、30 μg/mL的标准品溶液。按上述气相色谱-质谱条件进行检测，以大麻二酚质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2 火麻叶前处理

火麻叶经筛选后60℃烘干至恒重，然后置于高速多功能粉碎机中粉碎，分别过60、40、20目筛制备得到60、40、20目火麻叶粉及20目筛上物，密封保存于冰箱冷藏备用。

1.2.3 大麻二酚的提取和测定

分别称取不同粒径火麻叶粉，按一定料液比加入提取溶剂，在设定的温度、时间下热回流提取，冷却抽滤，将滤液在40℃下旋蒸浓缩制得浸膏。浸膏得率按下式计算：

Y=G1/G2×100%

式中：Y为浸膏得率，%；G1为浸膏的质量，g；G2为样品质量，g。

分别准确称取0.01 g浸膏，向其中加入10 mL甲醇，置于40 kHz超声波清洗机中，条件设置为功率200 W、温度20℃、时间3 min，之后过0.45 μm有机膜，所得滤液通过气相色谱-质谱检测并按照标准曲线计算浸膏中大麻二酚的含量。

同时在选择提取溶剂的基础上，以浸膏得率及浸膏中大麻二酚含量为指标，采用单因素试验对过筛粒径、料液比、提取温度和提取时间4个因素进行考察，并采用正交试验进行工艺优化。

1.2.4 统计分析

所有提取试验均重复3次，每次浸膏得率及大麻二酚含量的测定均重复3次，结果用“平均值±标准偏差”表示。应用SPSS软件对所有数据进行方差分析并作图，利用置信度为95%的最小显著性差异(P<0.05)比较平均值。

2 结果与讨论

2.1 大麻二酚标准曲线

以大麻二酚质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。得到大麻二酚标准曲线回归方程为Y=4.909×106X+3.119×106，相关系数为R2=0.993 1，在5～30 μg/mL之间线性关系良好。

2.2 提取溶剂的选择

准确称取粒径为20目的火麻叶粉，每份40 g，分别以正己烷、石油醚、无水乙醇作为提取溶剂，在料液比1∶15、提取时间3 h、提取温度80℃下进行提取，考察提取溶剂对浸膏得率及大麻二酚含量的影响，结果见图1。

图1 提取溶剂对浸膏得率及大麻二酚含量的影响

由图1可知，无水乙醇提取的浸膏得率最高，但其大麻二酚含量仅有19.70 mg/g，可能是无水乙醇极性偏大，导致醇溶性杂质、色素溶出[15]，正己烷和石油醚提取的浸膏得率差异不显著，但正己烷提取的大麻二酚含量明显高于石油醚。方差分析结果显示3种提取溶剂对浸膏中的大麻二酚含量影响达到显著水平(P<0.05)，因此选择正己烷为提取溶剂。

2.3 单因素试验

2.3.1 过筛粒径对大麻二酚提取的影响

准确称取一定量火麻叶粉，以正己烷为提取溶剂、料液比1∶10为提取溶剂量，在80℃下热回流提取3 h，考察过筛粒径对浸膏得率及大麻二酚含量的影响，结果见图2。

图2 过筛粒径对浸膏得率及大麻二酚含量的影响

由图2可知，20目筛上物的浸膏得率及大麻二酚含量均最低，分别为3.15%、15.04 mg/g，与另外3种不同粒径火麻叶粉相比差异显著(P<0.05)，这是由于物料与溶剂未能充分接触从而阻碍了有效成分的溶出。20、40目和60目相比对浸膏得率及大麻二酚含量的影响差异不显著，但考虑到粒径较大时选用普通的双联过滤器即可实现后续工艺的固液分离，具有成本低、能耗低等优点；粒径过小时通常需选择板框压滤机、卧螺离心机等能耗高的仪器实现固液分离，因此将火麻叶粉粒径控制在20目即可。

2.3.2 料液比对大麻二酚提取的影响

准确称取粒径为20目的火麻叶粉，以正己烷为提取溶剂，在80℃下热回流提取3 h，考察料液比对浸膏得率及大麻二酚含量的影响，结果见图3。

图3 料液比对浸膏得率及大麻二酚含量的影响

由图3可知，采用正己烷以料液比1∶10、1∶15、1∶20 提取时浸膏得率及大麻二酚含量没有显著差异，但显著高于料液比1∶5时的浸膏得率及大麻二酚含量(P<0.05)。研究表明料液之间的浓度梯度是提取物发生转移的动力，通过提高料液比，可以增加浓度梯度，有利于提取物的溶出。但当料液比达到某一值时，再提高料液比效果不大[16]，之后有减小的趋势，这可能是由于大麻二酚易氧化转变成另一种物质[17]。考虑到溶剂损耗、浓缩时间、工艺成本等问题，料液比确定为1∶10。

2.3.3 提取温度对大麻二酚提取的影响

准确称取粒径为20目的火麻叶粉，以正己烷为提取溶剂、料液比1∶10为提取溶剂量，在一定提取温度下热回流提取3 h，考察提取温度对浸膏得率及大麻二酚含量的影响，结果见图4。

图4 提取温度对浸膏得率及大麻二酚含量的影响

由图4可知，提取温度从60℃升至85℃，浸膏得率仅增加了0.89个百分点，但大麻二酚含量相应地从27.85 mg/g提高到34.39 mg/g，提取温度为80、85℃时大麻二酚含量稳定在34.39 mg/g左右。有报道指出，温度是提取过程中重要的影响因素，升高提取温度能够增加溶质的溶解度与溶解系数，有利于提取，但是超过一定的温度后，酚类物质就会发生降解[18]。故选择80℃作为提取温度。

2.3.4 提取时间对大麻二酚提取的影响

准确称取粒径为20目的火麻叶粉，以正己烷为提取溶剂、料液比1∶10为提取溶剂量，在80℃下热回流提取一段时间，考察提取时间对浸膏得率及大麻二酚含量的影响，结果见图5。

图5 提取时间对浸膏得率及大麻二酚含量的影响

由图5可知，在3 h内，提取时间对浸膏得率及大麻二酚含量影响显著(P<0.05)，随着提取时间的延长，大麻二酚含量先呈上升的趋势，提取时间为3 h时含量最高，显著高于1、2 h(P<0.05)，分别比提取1、2 h时高出了83.89%和22.45%。3.5 h时大麻二酚含量略微下降0.26 mg/g，可能是由于大麻二酚本身具有还原性，含有的两个酚羟基可以作为H供体，易被空气中的氧气所氧化。所以提取时间控制在3 h为宜。

2.4 正交试验优化

在单因素试验基础上，以浸膏得率及大麻二酚含量为指标，选用L9(34)正交试验设计对火麻叶中大麻二酚提取工艺参数进行优化，正交试验设计与结果如表1所示。

表1 火麻叶中大麻二酚提取正交试验设计及结果

由表1可知，4个因素对浸膏得率的影响程度由高到低依次为料液比>提取时间>过筛粒径>提取温度，4个因素对大麻二酚含量的影响程度由高到低依次为料液比>提取时间>提取温度>过筛粒径，提取最佳条件组合为A2B3C2D2，即过筛粒径20目、料液比1∶15、提取温度80℃、提取时间3 h。

利用SPSS软件对试验结果进行方差分析，结果见表2、表3。

表2 浸膏得率方差分析

由表2、表3可知：料液比对浸膏得率及大麻二酚含量的影响均达到极显著水平(P<0.01)；提取时间对浸膏得率的影响达到极显著水平(P<0.01)，对浸膏中大麻二酚含量的影响达到显著水平(P<0.05)；提取温度对浸膏得率及大麻二酚含量的影响均达到显著水平(P<0.05)；过筛粒径对浸膏得率的影响达到显著水平(P<0.05)，而对大麻二酚含量的影响不显著。

表3 大麻二酚含量方差分析

对最佳试验条件进行3次验证试验，测得浸膏得率为5.24%，大麻二酚含量为46.16 mg/g。试验提取的大麻二酚含量低，仍含有较多杂质，可以通过层析法、重结晶法等方法对其进行纯化，以提高大麻二酚纯度。

3 结 论

以火麻叶为原料，探讨了提取溶剂、过筛粒径、料液比、提取温度及提取时间对大麻二酚提取的影响，确定了最佳的工艺条件：正己烷作为提取溶剂，火麻叶粉碎过20目筛后按料液比1∶15热回流提取3 h，提取温度控制在80℃。在最佳工艺条件下，浸膏得率为5.24%，浸膏中大麻二酚含量为46.16 mg/g。