甲状腺结节穿刺标本中BRAF V600E突变检测的临床意义

张 玲，周晓燕，陈 颖，张 皓，高丽丽，王 宇，稽庆海，平 波，朱晓丽

1.复旦大学附属肿瘤医院病理科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学附属肿瘤医院头颈外科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率近年来快速上升［1］。目前，甲状腺细针抽吸细胞学检查（fine-needle aspiration cytology，FNAC）以其微创、易行及准确率高的特点，成为临床上诊断甲状腺结节良恶性最常用的方法，但仍有20%的病例无法明确诊断［2］。在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中，BRAF V600E突变是迄今报道最多的突变类型［3-5］。检测B超引导下甲状腺结节穿刺细胞中的BRAF V600E突变可辅助细胞学诊断，提高诊断的灵敏度和准确率。突变特异性扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）方法利用特异性引物和双环探针技术，将BRAF V600E检测灵敏度提高到1%的突变比例，大幅提高了检出率。本研究使用该方法对甲状腺穿刺细胞液进行BRAF V600E突变检测，以组织病理学诊断为金标准，评估BRAF V600E检测与细胞学诊断的灵敏度和特异度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

2016年6月—2017年4月在复旦大学附属肿瘤医院接受B超引导下甲状腺结节FNAC患者共563例，穿刺细胞液同时行细胞学诊断及BRAF V600E突变检测。

1.1.2 主要试剂与设备

QIAamp DNA Mini Kit试剂盒购自德国QIAGEN公司，人类BRAF V600E突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。Eppendorf 5810R低速离心机购自德国Eppendorf AG公司，Thermo-Shaker恒温金属浴购自美国Thermo Fisher Scientific公司，QIAcube核酸提取仪购自德国QIAGEN公司，Thermo NANOdrop2000核酸浓度测定仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，ABI7500实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）仪购自美国Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

穿刺细胞液用Eppendorf 5810R低速离心机4 000 r/min离心30 min，去上清液，吸取沉淀加入裂解液放入Thermo-Shaker恒温金属浴56 ℃消化过夜。用QIAcube核酸提取仪提取DNA，用Thermo NanoDrop2000核酸浓度测定仪进行定量，并将浓度统一稀释至2 ng/μL。

1.2.2 RTFQ-PCR检测

按上机样本数量配制RTFQ-PCR混合液，混匀后以每管35 μL分装到8联管中，将稀释好的DNA每个样本取5 μL加入反应管。混匀后以4 000 r/min离心15～20 s后放入ABI7500 RTFQPCR仪进行RTFQ-PCR并采集荧光信号，生成荧光信号值。RTFQ-PCR程序为：95 ℃ 5 min，1个循环（第一阶段）；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环（第二阶段）；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环（第三阶段）。信号收集：第三阶段60 ℃时收集突变FAM和内控HEX（或VIC）信号，执行RTFQ-PCR，保存文件。

1.2.3 BRAF V600E突变结果判读

按管号顺序依次选择单一突变检测反应管进行检测分析。需要同时选择阳性质控品反应孔、阴性对照孔和样品反应孔，可根据实际情况调节Threshold至扩增曲线升起的拐点处，得到突变FAM信号或内控HEX（或VIC）信号的Ct值。确定试验是否成功可信：待测样品的内控HEX（或VIC）信号应有明显扩增曲线，且Ct值应在13～21之间。若内控Ct值＞21或HEX信号无明显扩增，说明加入的DNA含有RTFQ-PCR抑制剂或DNA加入数量不够，需要重新提取DNA或增加DNA用量后再进行试验；但若FAM信号有明显的扩增曲线，且Ct值＜28，该样本无需重复检测，检测结果为BRAF V600E突变阳性。若内控Ct值＜13，说明加入的DNA过量，应减少DNA加入量再进行试验；但若FAM信号无明显扩增曲线或Ct值＞28，该样本无需重复检测，检测结果为BRAF V600E突变阴性。质控品的FAM信号Ct值一般＜20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。若样本的FAM信号Ct值≥28，则样本为阴性（或低于试剂盒的检测下限）；若样本的FAM信号Ct值＜28，则样本为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

在563例进行BRAF V600E突变检测的患者中，男女比例为1.0∶3.7（120∶443），年龄1～79岁，平均年龄（45.0±0.9）岁（表1）。BRAF V600E检测成功率为99.3%（559/563），4例检测失败，无法判断结果（ARMS方法检测无HEX峰升起，提示扩增失败），BRAF V600E的总体突变率为50%。将标本按细胞学诊断分为6级，其中良性32例，未见肿瘤细胞182例，非典型病变42例，个别异型细胞9例，疑滤泡性肿瘤6例，PTC及疑PTC 292例。

表 1 甲状腺结节FNAC标本中BRAF V600E突变检出率、细胞量及DNA浓度Tab. 1 BRAF V600E mutation, cell number and DNA concentration in the FNAC samples of thyroid nodule

388例FNAC标本做细胞量评估，样本总体均数可信区间为95%，细胞量评估＞60个细胞的样本提取的DNA浓度均值为（9.0±1.2）ng/μL，细胞量评估＜60个细胞的样本提取的DNA浓度均值为（6.0±1.7）ng/μL，两组平均浓度均小于10 ng/μL。成组设计的t检验进行两样本均数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

209例患者接受手术并有组织病理学诊断结果，将组织病理学诊断作为金标准，评估细胞学及BRAF V600E检测的准确率。细胞学诊断PTC的灵敏度为86.6%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为20.6%。BRAF V600E单独诊断甲状腺恶性肿瘤的灵敏度为78.2%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为13.7%。FNAC联合BRAF V600E诊断PTC的灵敏度为92.1%，特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，阴性预测值为30.4%（表2）。FNAC联合BRAF V600E检测的阳性检出率高于单独FNAC及单独BRAF V600E检测，差异有统计学意义（P＜0.005）。

组织病理学诊断为PTC的患者中，有11例患者细胞学诊断未见肿瘤细胞，但BRAF V600E检测阳性，其中9例为微小PTC，2例为PTC，4例细胞量评估＞60，4例细胞量评估＜60，3例不满意。

表 2 细胞学诊断和BRAF V600E诊断与组织病理学诊断金标准的比对Tab. 2 Comparison of cytological diagnosis and BRAF V600E diagnosis with histopathologic diagnosis

3 讨 论

PTC是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占甲状腺恶性肿瘤的80%［6］，近年来发病率明显增高。目前研究发现，在PTC中BRAF V600E突变是最常见的基因异常，突变率为45%～80%［7-8］。BRAF V600E突变后可持续性激活Ras基因/丝苏氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶（Ras/serine/threonine-protein kinase/mitogenactivated protein kinase kinase/mitogen-activated protein kinase，Ras/Raf/MAPKK/MAPK）信号通路促使甲状腺细胞增殖，使滤泡上皮细胞发生恶变，并可促进高分化乳头状癌细胞发展为低分化和未分化癌细胞［9］。

目前甲状腺结节穿刺的细胞学诊断是术前良恶性诊断的重要手段，但是约20%的甲状腺FNAC标本细胞学无法明确诊断［10-13］，其恶性风险度为1.7%～6.6%［14］，该组患者常需要再次穿刺或易漏检。因此，有学者开始将分子检测应用于FNAC标本，期望提高FNAC术前诊断的准确率。本研究用ARMS方法检测B超引导下甲状腺FNAC组织中的BRAF V600E突变，检测成功率高达99.3%，方法简便快速，适用于临床术前辅助诊断。本研究中，评估比较细胞量＞60和＜60个细胞的两组FNAC标本的DNA提取浓度，均低于10 ng/μL，差异无统计学意义，细胞量的多少未影响DNA提取的浓度，可能由于细胞学评估并不能完全反映穿刺液中的实际细胞量。分析4例BRAF V600E突变检测失败的病例，细胞量的多少和DNA浓度的高低与检测是否成功并不相关，推测导致ARMS方法检测失败的因素可能有DNA质量差和残留的荧光抑制剂等。本研究中，甲状腺结节细胞学诊断的灵敏度为86.6%，将细胞学诊断与BRAF V600E检测结果相结合，灵敏度提高到92.1%，说明细胞学诊断联合BRAF V600E检测的准确率优于单独细胞学诊断或单独BRAF V600E检测。分析11例组织病理学诊断及BRAF V600E检测阳性、细胞学诊断阴性的病例，其中9例术后诊断为微小PTC，说明在微小PTC中，可能穿刺所得肿瘤细胞量较少，导致细胞学诊断时易发生漏检，而分子检测BRAF V600E突变是将DNA呈指数级放大，检测灵敏度更高，因此对于微小PTC，BRAF V600E突变与细胞学检测二者结合可明显提高诊断准确率，降低漏检率。

综上所述，术前甲状腺结节FNAC标本中用ARMS方法检测BRAF V600E成功率高，是临床上简单易行的方法，细胞学诊断与BRAF V600E同时检测，可提高甲状腺结节FNAC的术前诊断准确率。