茯苓四逆汤对脓毒症大鼠心肌保护机制的研究*

王 评 彭晓洪 黄永莲 黄亚秀 李少萍 曹齐凤 陈冬杰 胡世平

（广东省深圳市龙岗区中医院，广东 深圳 518172）

脓毒症是临床急危重症，是临床危重症患者的主要死亡原因之一［1-2］。心肌抑制是脓毒症或脓毒症休克最常见的并发症之一，其发生率高达50%，其死亡率达70%～90%，而无心脏受累的脓毒症患者死亡率只有20%，是造成脓毒症预后不良的重要原因之一［3］。脓毒症心肌抑制对人类健康构成严重威胁，且医疗费用较高，给社会、家庭带来巨大的经济负担。有效预防和治疗脓毒症过程中出现的心肌损伤是脓毒症治疗的重要组成部分［4］。关于脓毒症心肌抑制的发病机制尚不完全明确，目前相关的学说主要涉及心肌缺血和微循环功能障碍、内皮功能障碍、线粒体损伤、炎症反应等［5-6］。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是反映心肌损害的理想生化标志物，H-FABP与当前诊断心肌损伤的“金标准”肌钙蛋白有着更好的敏感性［7］。而且在心肌损伤的可逆性期，H-FABP的检测性要优于超敏肌钙蛋白［8］。茯苓四逆汤见于《伤寒论》，是温阳育阴、活血利水的代表方。本研究通过制造脓毒症大鼠模型，研究茯苓四逆汤对脓毒症心肌抑制的作用，并探讨其对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、H-FABP 的影响，探讨茯苓四逆汤治疗脓毒症心肌抑制的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠100只，质量（200±30）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。

1.2 药剂与仪器 茯苓四逆汤由北京中医药大学深圳医院中药房煎制，茯苓四逆汤中茯苓30 g，熟附子10 g，党参5 g，干姜8 g，炙甘草10 g。大鼠灌胃剂量参照血清药理学等效剂量换算公式进行换算，成人茯苓四逆汤用药量为1.05 g/（kg·d），成人到大鼠的换算系数Rab=6.17，则200 g大鼠的等效剂量折算为1.3 g，低、中、高剂量分别为 1 倍（1.3 g/d）、2 倍（2.6 g/d）、3倍（3.9 g/d）等效剂量作为大鼠灌胃给药剂量。TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒 （美国R＆D公司），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术公司）、PCR仪（美国Perkinelmer公司），紫外凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱和酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 分组与造模 SPF级SD雄性大鼠100只，适应性饲养3 d，按随机数字表法分为以下5组：假手术组，脓毒症组，茯苓四逆汤低剂量组，茯苓四逆汤中剂量组，茯苓四逆汤高剂量组。大鼠模型建立脓毒症模型：通过盲肠结扎穿孔术（CLP）法，诱导制造动物模型［9］。腹腔注射0.4 mL/kg 10%水合氯醛，待麻醉满意后，将大鼠固定于手术台，常规消毒胸腹部皮肤，剑突下约2 cm处沿腹正中线剪开腹壁约1 cm，找出盲肠，用5号线结扎约1/3盲肠，用21G针头贯通穿刺结扎部位的盲肠2次，轻轻挤压使少量肠内容物溢出，将处理好的盲肠回纳入腹腔，缝合腹腔。术毕，颈后皮肤常规消毒后皮下注射10 mL 0.9%氯化钠注射液进行液体复苏，麻醉苏醒后单笼饲养。假手术组模型：对试验大鼠开腹，取出盲肠，不结扎和穿孔，术后还纳盲肠并关腹。待大鼠苏醒后自由饮水正常进食，单独饲养。6 h后除对照组外其余各组按照分组进行给药，假手术组及脓毒症组灌胃0.9%氯化钠注射液，其余各组灌胃加味茯苓四逆汤。每天观察大鼠的生存状态和生存时间。分别在术前及术后24 h、48 h、72 h 3个时间点选5只大鼠尾静脉取血并处死，取心肌组织后超低温保存备用，测定 TNF-α、IL-6、H-FABP 水平。

1.4 标本采集与检测 1）TNF-α和IL-6的测定。收集各组大鼠尾静脉血8 mL，4 000 r/min离心10 min，留取上层血清并分置于EP管中，采用ELLISA法检测血清中的TNF-α和IL-6的含量，将试剂盒置于室温平衡30 min，按照ELLISA试剂盒说明进行操作，完毕后用全自动酶标仪在450 nm波长读取吸光度值，绘制标准曲线，根据各标本吸光度值在标准曲线上得出相应的浓度。2）FABP的测定。收集各组心肌细胞，充分裂解后，离心5 min取上清液，取部分上清蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。然后每组取10 μL样品以及蛋白标准物点样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始电压为90 V，观察Marker的移动情况，适时终止电泳。转膜、封闭、洗膜，切割后分别与其特定的稀释过的一抗4℃杂交过夜，然后用TBST洗膜3次，与二抗反应至少1 h，再次洗膜3次，加ECL显色，上机检测。1.5 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 脓毒症组大鼠术前24 h有3只大鼠死亡，饮食饮水减少，呼吸频率加快，毛发蓬松无光泽，大便稀软等症状。术后症状慢慢改善。低、中、高剂量组也出现脓毒症组的表现，但无大鼠死亡，且给药后症状较脓毒症组减轻。假手术组大鼠饮食饮水均正常，手术前48 h活动量下降，后恢复正常。

2.2 各组TNF-α、IL-6检测结果比较 见表1～表2。除假手术组外，其他4组大鼠血清TNF-α、IL-6水平含量于手术后均明显升高，与假手术组差异有统计学意义（P＜0.01）；随着时间增加，TNF-α、IL-6 含量逐渐降低；同一时间，中药各剂量组与脓毒症组在不同时间点的血清TNF-α、IL-6水平差异有统计学意义（P＜0.01）；不同剂量治疗组中比较发现，剂量越高，其TNF-α、IL-6水平降低得越明显（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各组不同时间点IL-6水平比较（x±s）

表1 各组不同时间点IL-6水平比较（x±s）

与假手术组同时间点比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与脓毒症组同时间点比较，△P＜0.05，△△P＜0.01； 与低剂量组同时间点比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与中剂量组同时间点比较，◇P＜0.05。下同。

组 别 n假手术组 5脓毒症组 5低剂量组 5术前 术后24 h 术后48 h 术后72 h 197.35±6.0 188.35±7.9 186.61±5.5 194.45±8.3 191.86±9.4 585.22±31.5** 455.07±15.4** 374.71±12.7**188.92±12.9 472.6±16.3**△△ 377.47±15.7**△△ 300.9±25.0**△△中剂量组 5 189.82±8.3 361.48±12.4**△△# 294.35±14.5**△△#266.45±18.9**△△#高剂量组 5 187.08±10.8 291.34±14.6**△△##◇ 255.88±8.2**△△##◇ 212.76±26.5**△△##◇

2.3 各组H-FABP检测水平比较 见表3。除假手术组外，其他各组大鼠血清H-FABP水平含量于手术后均明显升高；脓毒症组和中药各剂量组H-FABP在造模后明显表达量上升且和假手术组差异有统计学意义（P＜0.01），随着时间增加，含量逐渐降低；同一时间，治疗组与脓毒症组在不同时间点的血清H-FABP水平差异有统计学意义（P＜0.05）；不同剂量治疗组中比较发现，随着时间的延长，剂量越高的茯苓四逆汤对于改善H-FABP水平越好。

表2 各组不同时间点TNF-α水平比较（x±s）

表2 各组不同时间点TNF-α水平比较（x±s）

组 别 n假手术组 5脓毒症组 5低剂量组 5术前 术后24 h 术后48 h 术后72 h 191.04±10.3 191.7±6.1 193.1±18.1 195.2±11.8 183.5±10.8 677.8±62.7** 527.0±40.3** 409.6±52.8**189.3±20.2 585.9±43.0**△△ 477.7±32.4**△△ 381.4±20.6**△△中剂量组 5 184.3±23.0 486.2±25.3**△△# 395.4±22.4**△△# 284.1±26.9**△△#高剂量组 5 183.0±12.4 422.8±32.0**△△##◇ 342.2±32.8**△△##◇ 228.0±33.0**△△##◇

表3 两组不同时间点H-FABP水平比较（x±s）

表3 两组不同时间点H-FABP水平比较（x±s）

组 别 n假手术组 5脓毒症组 5低剂量组 5术前 术后24 h 术后48 h 术后72 h 1.52±0.02 1.63±0.01 1.59±0.02 1.62±0.10 1.53±0.01 3.69±0.26** 3.35±0.12** 2.31±0.14**1.62±0.01 3.52±0.13**△ 3.04±0.24**△ 2.22±0.34**中剂量组 5 1.65±0.01 3.39±0.22**△ 2.87±0.31**△ 1.95±0.17*高剂量组 5 1.67±0.02 2.96±0.15**△△# 2.44±0.21**△△# 1.66±0.02△△#◇

3 讨 论

脓毒症是指各种致病微生物侵入机体致感染后引起的全身炎症反应综合征，是创伤、烧伤、休克、感染和大手术等临床急危重症患者的严重并发症之一，严重者可进一步发展为严重脓毒症、脓毒症休克、多器官功能障碍综合征，是临床危重症患者的主要死亡原因之一［10］。在脓毒症的发病过程中，心脏、肺脏和肾脏是最常见和最容易受影响的脏器器官。脓毒症的本质是过度反应的全身炎症综合征，TNF-α、IL-6是全身炎症时候细胞分泌的重要炎症介质，并且目前的相关动物实验研究发现TNF-α可以促进心肌炎性改变以及心肌细胞的凋亡从而引起心脏功能障碍［11］。H-FABP是一种可溶性蛋白，主要分布于脂肪酸代谢旺盛的组织，其在心肌组织中的含量是骨骼肌的10倍［12］。在正常生理情况下，心型脂肪酸结合蛋白参与心肌细胞的脂肪酸转运及能量代谢，在维持心肌的存活和正常功能中发挥重要作用［13-14］。而当心肌细胞出现损伤时，能量代谢出现紊乱，心型脂肪酸结合蛋白可透过细胞膜大量释放于组织间，因此其对于心肌损伤有着极高的敏感性［15］。

通过本实验可以发现，在造模成功24 h后TNF-α、IL-6的水平达到最高水平，其后开始出现下降趋势，且同时期H-FABP水平也在造模成功后24 h达到最高峰，并随着时间的延长逐渐下降，而在假手术组中，大鼠的TNF-α、IL-6水平并没有升高，而且同时其H-FABP水平也未出现明显变化，证明了出现全身炎症反应时，心肌细胞会受到抑制并出现损伤，该结果与国内相关研究结果相一致［16］。并且通过对比脓毒症组和各剂量中药组可以发现，茯苓四逆汤能够有效降低TNF-α、IL-6及 H-FABP水平。

对于茯苓四逆汤降低H-FABP水平的机理，结合本实验其他的结果，可以猜测出是由于茯苓四逆汤能够通过抑制炎症反应，减少炎症因子的生成，从而直接损害心肌细胞。目前国内外对于炎症因子如何造成心肌损害的机理尚未明确，因此本实验仍需进一步研究其内在机理，为明确茯苓四逆汤保护心肌抑制的分子途径提供证据。

综上，茯苓四逆汤能够有效抑制脓毒症大鼠的炎症反应，并且对于心肌抑制也起到保护作用，其机理可能与通过抑制炎症反应，减少炎症因子生成相关。