淫羊藿提取物对骨质疏松骨折大鼠愈合过程Notch信号通路的影响*

孙杰 宋鑫 王健

（上海市健康医学院附属浦东新区人民医院，上海 201200）

骨质疏松是多种原因引起的一组骨病，使骨折的风险增加，绝经后的妇女尤其容易患骨质疏松症，雌激素缺乏被认为是导致这种疾病的主要原因［1］。使用雌激素替代疗法（ERT）对防止或延缓绝经后骨质疏松的发生具有较好的效果［2］。同时研究提示，使用ERT可以增加绝经后妇女患心血管疾病、卵巢癌和乳腺癌的风险［3-5］。因此，寻找预防和治疗骨质疏松症的替代方法值得探索。中国的草药用于治疗骨折和关节疾病已经有数千年的历史。淫羊藿是治疗骨质疏松症最常用的草药之一，具有“强肾”的功能［6］。中国的许多科学家先前的研究已经反复证明，淫羊藿提取物可以减少卵巢切除大鼠模型以及老化或其他大鼠模型中的骨质流失，但其作用机制还不清楚［7］。研究提示，Notch信号通路通过抑制成骨细胞分化，抑制骨原细胞分化，同时抑制原发性骨髓基质细胞的脂肪生成［8］。但淫羊藿提取物能否通过调控Notch信号通路来发挥治疗骨质疏松的作用还不清楚。因此本研究通过制作大鼠骨质疏松骨折模型，探讨淫羊藿提取物对骨质疏松骨折大鼠的治疗效果及Notch信号通路发挥的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康3月龄雌性SD大鼠25只，体质量220～240 g。SD大鼠由山东省医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（鲁）2012-0002。动物合格证编号：2015000577866。在温度为18～24℃、湿度为40%～70%、控制饲养环境昼夜循环（12 h/12 h）的SPF环境中自由进食和饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：淫羊藿提取物购自石家庄以岭药业股份有限公司，棕色干粉，淫羊藿苷含量为54.56%，批号20161017。2）试剂：10%水合氯醛购自上海山浦化工有限公司；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；蛋白抽提试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Notch1、骨保护素（OPG）、RANKL酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。3）仪器：克氏针购自上海沪江医疗器材有限公司；Norland-XR36双能X射线骨密度仪购自美国Norland-XR36公司；显微CT购自比利时SkyScan公司；HBS-1096B酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备购自德国Leica公司；高速冷冻离心机购自德国SORVALL Heraeus公司。

1.3 分组与造模 大鼠适应性喂养1周后进行实验。根据随机数字表法将大鼠分为正常骨折组10只和骨质疏松组15只。用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后进行备皮消毒后，采用背部双侧去卵巢术切除双侧卵巢，正常骨折组只仅暴露腹腔，不切除卵巢，关闭伤口。术后给予20万U青霉素肌肉注射，连续使用3 d。在温度为18～24℃、湿度为40%～70%、控制饲养环境昼夜循环（12 h/12 h）的SPF环境中自由进食和饮水。术后3月，根据随机数字表法从正常骨折组和骨质疏松组各选5只大鼠处死后检测股骨骨密度确定骨质疏松模型制作成功。对所有大鼠制备右侧股骨干中段横行骨折模型［9］。将骨质疏松组分为骨质疏松骨折组和淫羊藿治疗组。

1.4 干预方法 淫羊藿治疗组灌胃给予浓度为110 mg/（kg·d）的淫羊藿提取物，正常骨折组和骨质疏松骨折组给予等量0.9%氯化钠注射液，连续给予8周，心脏取血处死大鼠，取右侧股骨，剔除软组织后进行相关检测。

1.5 观察指标 1）骨密度测定：用Norland-XR36双能X射线骨密度仪对大鼠右侧股骨骨密度测量。采用小物体扫描模式：扫描速度为60 mm/s、扫描宽度5.0 cm、分辨率 1.0 mm×1.0 mm、准确度 0.01%。2）血清中ALP含量的测定：分离大鼠血清，根据碱性磷酸酶（ALP）试剂盒说明书（A059-2）进行ALP含量的测定。3）1.5 micro CT扫描：骨密度测定完成后，进行microCT扫描（扫描参数：电压 80 kV、电流 80 μA、功率40 W、旋转角度 360°、分辨率 21 μm、像素组合 1×1、帧平均数6）。用ZKKS-SHARP软件进行分析，获得相对骨体积（BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨体积比（BV/TV）等股骨远端参数。4）病理学检测：取骨痂组织进行常规甲醛固定、脱钙、脱水、包埋、切片（2.0 μm）、苏木精-伊红染色 （HE染色），观察骨痂组织学特点。5）ELISA法检测Notch1、OPG和RANKL蛋白表达水平：取骨折端骨组织，用液氮冷冻后进行研磨，将组织转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL磷酸盐缓冲液后离心取上清，根据ELISA试剂盒说明书进行Notch1、OPG和RANK1蛋白含量测定。

1.6 统计学处理 应用IBM SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，分析前进行正态性检验，采用单因素方差分析进行判断，组间两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠骨密度和ALP水平比较 见表1。与正常骨折组比较，骨质疏松骨折组和淫羊藿治疗组大鼠骨密度显著降低，ALP含量增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与骨质疏松骨折组比较，淫羊藿治疗组大鼠骨密度显著增加，ALP含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠股骨远端参数的比较 见表2，图1。Micro-CT扫描可见，正常骨折组和淫羊藿治疗组骨折部位对合良好，骨重塑规则匀称，骨质疏松骨折组骨折端依然存在较明显的间隙。与正常骨折组比较，骨质疏松骨折组BV、BV/TV和Tb.Th显著降低，差异具有统计学意义 （P＜0.05），淫羊藿治疗组BV、BV/TV和Tb.Th降低不显著，差异无统计学意义（P>0.05）；与骨质疏松骨折组比较，淫羊藿治疗组BV、BV/TV和Tb.Th显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠骨密度和ALP水平比较（x±s）

表1 各组大鼠骨密度和ALP水平比较（x±s）

与正常骨折组比较，*P＜0.05；与骨质疏松骨折组比较，△P＜0.05。下同

组 别 n 骨密度（g/cm2） ALP（U/L）正常骨折组 5 0.19±0.02 73.54±4.19骨质疏松骨折组 5 0.15±0.01* 101.58±7.24*淫羊藿治疗组 5 0.18±0.02*△ 85.10±8.43*△

表2 各组大鼠股骨远端参数的比较（x±s）

表2 各组大鼠股骨远端参数的比较（x±s）

组 别 n Tb.Th（μL）BV（mm3） BV/TV（%）正常骨折组 5 88.04±4.95骨质疏松骨折组 5 72.30±5.18*60.15±4.19 58.72±3.84 44.57±4.83*54.68±5.62*淫羊藿治疗组 5 85.37±7.65△58.94±7.31△ 57.67±6.28△

图1 大鼠右侧胫骨骨折处冠状位、矢状位与横截面Micro-CT扫描

2.3 各组大鼠骨痂HE组织学观察结果 见图2。正常骨折组可见成熟骨小梁形成，处于软骨性骨痂向骨性骨痂转换阶段；骨质疏松性骨折组骨痂邻近原骨小梁细小松散，向骨性骨痂转化过程明显延迟；淫羊藿治疗组形态介于正常骨折组和骨质疏松性骨折组之间。

图2各组大鼠骨痂组织学观察结果（HE染色，100倍）

2.4 各组骨组织中Notch1、OPG和RANKL蛋白表达水平比较 见表3。与正常骨折组比较，骨质疏松骨折组和淫羊藿治疗组Notch1和OPG显著降低，RANKL显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与骨质疏松骨折组比较，淫羊藿治疗组Notch1和OPG显著增高，RANKL显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组骨组织中Notch1、OPG和RANKL蛋白表达水平比较（ng/g，x±s）

表3 各组骨组织中Notch1、OPG和RANKL蛋白表达水平比较（ng/g，x±s）

组别 n RANK1 Notch1 OPG正常骨折组 5 2.54±0.17骨质疏松骨折组 5 4.33±0.56 2.68±0.21 1.83±0.13 0.84±0.06* 0.90±0.05淫羊藿治疗组 5 2.82±0.40 1.69±40.09 1.54±0.11

3 讨 论

目前，抗骨质疏松药物的研究主要在抑制骨吸收（雌激素、降钙素、雷洛昔芬）和刺激骨形成（氟化物、合成代谢类固醇）［10］。其中，ERT是一种流行的预防和治疗绝经后骨质疏松症的方法，但潜在风险较高。植物雌激素具有与内源性雌激素相似的结构和生物活性，体外和动物研究的证据表明，植物雌激素不仅在与雌激素受体结合方面与雌激素竞争，而且具有弱雌激素或抗雌激素活性［11］。动物和人类研究表明，摄入植物雌激素可以降低乳腺癌的发病率［12］。淫羊藿广泛用于骨病治疗，黄酮类化合物是其主要的有效成分，可能通过雌激素受体发挥雌激素样作用，对肿瘤细胞无增生性作用［13］。淫羊藿作为治疗骨质疏松症的替代疗法在国际上未被广泛接受，原因是对其作用机制和未知的活性成分缺乏明确的认识。本研究通过评价淫羊藿提取物对骨质疏松骨折大鼠愈合过程的作用发现，口服淫羊藿提取物8周后，可以减低血清ALP的活性，使骨密度增加，促进骨形成，这些骨保护作用与其他研究报道的ERT的骨保护作用相似。

本研究进一步证实了淫羊藿提取物对Notch信号通路的影响。Notch具有Notch1-4 4个受体，存在高度的结构同源性，其中Notch1可能是所有4个Notch受体的主要功能［14］。在体内和体外的成骨细胞中以及在骨再生过程中检测到Notch1的表达，通过抑制破骨细胞的分化和成熟来增加其活性，促进骨矿物质沉积［15］。RANKL和OPG是骨吸收的关键调控因子，直接作用于破骨细胞。RANKL已被确认为一种关键的细胞因子，可调节破骨细胞生成和骨吸收［16］。成骨细胞产生的OPG对于巨噬细胞-破骨细胞谱系的细胞生存是必需的，OPG可以竞争性RANKL，使破骨细胞的生产减少，RANKL/OPG浓度比例决定了破骨细胞分化、成熟及功能，并最终影响骨密度、强度和重建［17-18］。本研究结果显示，淫羊藿提取物能提高Notch1和OPG表达，降低RANKL表达。然而，在明确了淫羊藿提取物对骨质疏松治疗效果后，为了使国际科学界对淫羊藿提取物作为骨病治疗的替代方案认可，还需要更多的研究来确定淫羊藿提取物的活性成分以及在体内介导的作用机制。

综上所述，淫羊藿提取物对骨质疏松骨折大鼠具有较好的治疗作用，其机制可能与淫羊藿提取物能抑制ALP的活力、提高Notch1、OPG表达、抑制RANKL的表达、促进骨形成，提高骨密度有关。然而，为了淫羊藿提取物作为骨病治疗的替代方案得到国际的认可，还需确定HEP提取物的活性成分及作用的机制。