泻肺定喘汤对中性粒细胞型哮喘大鼠KLF-2/RelA比例平衡及中性粒细胞凋亡的影响*

韩 莹 蔡庆宇 张 岩

（1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江省佳木斯市中医院，黑龙江 佳木斯 154002；3.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江 佳木斯 154002）

支气管哮喘是一种由多种细胞和细胞组分共同参与的，以可变性呼气气流受限、气道高反应和气道重塑为特征的呼吸道炎症性疾病［1］。根据最新的一项调查显示，哮喘的总发病率为6.79%，其中以0～15岁及55～64岁的人群发病率最高，分别为13.05%和10.56%，且女性显著高于男性［2］。而且随着近年来环境污染的加剧和生活方式的改变，本病的发病率和死亡率呈现逐年增高的趋势，已成为世界性的公共卫生问题。

2009年全球哮喘防治创议首次提出 “表型”的概念，通过疾病表型的分类，能够更好地指导哮喘的治疗和预后的判断。过去的研究认为嗜酸性粒细胞（EA）是哮喘气道炎症反应的主要原因，但是越来越多的研究发现，超过50%的哮喘是以中性粒细胞浸润为主［3］。与EA 相比，中性粒细胞型哮喘（NA）的临床表现及肺功能更差，急性发作的次数更多，而且缺乏有效的治疗措施［4］。因此，本研究通过采用泻肺定喘汤进行干预NA模型，并观察KLF-2/RelA比例的平衡及中性粒细胞的凋亡，以明确泻肺定喘汤的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 48只6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量（213±12）g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心［动物合格证批号：SCXK（黑）2015-003］。 购入后置于黑龙江中医药大学佳木斯学院实验中心饲养，饲养条件2级，温度18～27℃，相对湿度45%～75%，自由饮水，常规喂养。

1.2 药剂和仪器 泻肺定喘汤由白果15 g，麻黄10 g，桑白皮 10 g，地骨皮 10 g，款冬花 10 g，黄芩 10 g，紫苏子10 g，法半夏5 g，杏仁5 g，炙甘草5 g组成，购于佳木斯市中医院中草药局。药物置于冷水中浸泡2 h后煎煮至生药质量浓度为低（0.5 g/mL）、中（1 g/mL）和高（2 g/mL）的药汁。 脂多糖（LPS）、10%卵白蛋白（OVA）、Percoll分离液均购于美国Sigma公司；台盼蓝染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；瑞氏染色试剂盒购于上海君瑞生物技术有限公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，兔抗大鼠 KLF-2、RelA（p65）、促凋亡基因（Bax）和抑制凋亡基因（Bcl-2）多克隆抗体购于美国Abcam公司；兔抗大鼠β-actin、HRP标记山羊抗兔IgG和超敏ECL化学发光试剂盒购于沈阳万类生物科技公司；光学显微镜购于日本Olympus公司；流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司；超声雾化器购于上海鱼跃医疗设备有限公司；电泳仪、电泳槽和凝胶成像分析系统均购于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分组与造模 大鼠随机分为空白组（Control）、模型组（NA）、地塞米松组（DXN）、泻肺定喘汤低剂量组（XFD Low）、泻肺定喘汤中剂量组（XFD Medium）和泻肺定喘汤高剂量组（XFD High），每组8只。除空白组外，余组大鼠均按照文献中方法复制NA模型［5-6］，具体方法如下：于实验开始后的第0天、第7天和第14天腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉后，LPS鼻腔滴入（0.1 μg）和 OVA 腹腔注射（100 μg）联合致敏，从第 15天开始给予OVA（10 g/L）雾化吸入激发，每日1次，每次30 min，连续2周。空白组大鼠给予生理盐水替代LPS和OVA致敏和激发。

1.4 给药方法 各药物干预组于第15天开始，在每次雾化吸入激发前30 min给予相应的药物治疗。其中地塞米松组给予地塞米松混悬液0.75 mg/kg灌胃，中药治疗药量参照体表面积法计算［7］，泻肺定喘汤各剂量组分别给予0.5 g/kg、1 g/kg和2 g/kg的泻肺定喘汤灌胃治疗，而空白组和模型组给予等量的0.9%氯化钠注射液灌胃治疗，上述灌胃治疗每日1次，连续2周。

1.5 标本采集与检测 1）肺泡灌洗液的采集：于末次雾化激发24 h后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用磷酸缓冲溶液（PBS）灌洗肺泡，按照文献中方法［8］收集支气管肺泡灌洗液，1 500 r/min离心后，回收离心后的细胞沉淀，加入红细胞裂解液，1 500 r/min离心，弃上清液，用于检测。中性粒细胞的分离纯化：采用密度梯度离心法分离制备中性粒细胞。于腹主动脉取血5 mL，加入装有Percoll分离液的离心管中，400 g离心30 min，取中性粒细胞富集层，0.01 mol/L的PBS洗1遍，低渗法去除红细胞，PBS重复洗1遍后加入PBS 4 mL悬浮成5×103个/mL，分别采用台盼蓝染色和瑞氏染色检查细胞活力和纯度后立即使用。肺泡灌洗液中细胞计数和分类：取离心后的肺泡灌洗液沉淀，用1 mL PBS重悬细胞，于细胞计数板上进行细胞计数。同时，取20 μL的细胞悬液涂片，固定于染色架上，经瑞氏染色后于光学显微镜下做细胞分类计数。2）流式细胞术检测中性粒细胞的凋亡：将分离纯化的中性粒细胞用200 μL Binding Buffer重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL， 每个样本约为 100 μL， 加入 5 μL An nexin V和10 μL的PI溶液，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS重悬，流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。3）蛋白质印迹法检测中性粒细胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白的表达：采用RIPA裂解液进行总蛋白提取，测定蛋白浓度；加入10%SDSPAGE蛋白上样缓冲液进行蛋白分离，电泳，转膜；脱脂牛奶封闭 2 h，加入 KLF2（1∶1 500）、RelA（1∶1 500）、Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和 β-actin（1∶500）一抗于4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤后加入HRP标记的二抗，TBST缓冲液洗涤两次，加入超敏ECL化学发光剂显影，凝胶图像分析系统分析各蛋白条带灰度值，并以 β-actin为内参，计算 KLF-2、RelA、Bax和 Bcl-2蛋白的相对表达值。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间的数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肺泡灌洗液中白细胞计数和分类的比较见表1。造模后，肺泡灌洗液中白细胞数量显著增加，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的百分比均显著升高，与空白组比较，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；药物干预后，地塞米松和泻肺定喘汤中、高剂量组大鼠肺泡灌洗液中白细胞数量显著减少，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的百分比均显著降低，与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01），其中以泻肺定喘汤高剂量组疗效最佳。

表1 各组肺泡灌洗液中细胞计数和分类的比较（x±s）

表1 各组肺泡灌洗液中细胞计数和分类的比较（x±s）

与空白比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组 别 n空白组 8模型组 8地塞米松组 8嗜酸性粒细胞（%） 淋巴细胞（%）0.80±0.10 0.63±0.05 1.43±0.18** 1.11±0.06**1.02±0.08△△ 0.90±0.08△△泻肺定喘汤低剂量组 8 33.84±10.97 34.12±9.35 1.42±0.18 0.95±0.09△△泻肺定喘汤中剂量组 8 19.25±7.19△△ 26.20±10.24△△ 1.15±0.13△△ 0.90±0.09△△泻肺定喘汤高剂量组 8 9.44±2.63△△ 18.20±6.69△△ 0.87±0.06△△ 0.70±0.04△△白细胞计数（105/mL） 中性粒细胞（%）7.61±1.27 10.23±2.87 36.75±9.79** 36.60±4.59**15.42±3.97△△ 20.72±4.95△△

2.2 各组中性粒细胞凋亡率的比较 见表2。造模后，模型组大鼠中性粒细胞的凋亡率显著降低，与空白组比较，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；地塞米松和泻肺定喘汤中、高剂量组均能显著增加哮喘大鼠中性粒细胞的凋亡，与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组中性粒细胞凋亡率比较（x±s）

表2 各组中性粒细胞凋亡率比较（x±s）

组 别 n 细胞凋亡率（%）空白组 8 7.15±1.12模型组 8 4.07±1.01**地塞米松组 8 8.83±3.13△△泻肺定喘汤低剂量组 8 5.48±1.44泻肺定喘汤中剂量组 8 7.88±1.09△△泻肺定喘汤高剂量组 8 12.05±3.91△△

2.3 各组中性粒细胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白表达的比较 见表3～表4，图1～图2。造模后，模型组大鼠中性粒细胞中KLF2、RelA蛋白的表达及KLF-2/RelA的比值显著降低，与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；地塞米松和泻肺定喘汤中、高剂量组均能显著增加中性粒细胞中KLF2、RelA蛋白的表达及上调KLF-2/RelA的比值，与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。造模后，模型组大鼠中性粒细胞中Bax蛋白的表达及Bax/Bcl-2的比值显著降低，Bcl-2蛋白的表达显著升高，与空白组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；地塞米松和泻肺定喘汤中、高剂量组均能显著增加中性粒细胞中Bax蛋白的表达及上调Bax/Bcl-2的比值，降低Bcl-2蛋白的表达，与模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组中性粒细胞中KLF2和RelA蛋白表达的比较（x±s）

表3 各组中性粒细胞中KLF2和RelA蛋白表达的比较（x±s）

组 别 n空白组 8模型组 8地塞米松组 8 KLF2/RelA 2.66±0.72 1.24±0.28**3.00±0.56△△泻肺定喘汤低剂量组 8 0.19±0.06 0.13±0.02 1.57±0.76泻肺定喘汤中剂量组 8 0.34±0.04△△ 0.17±0.02△△ 2.03±0.33△△泻肺定喘汤高剂量组 8 0.59±0.06△△ 0.19±0.05△△ 3.31±1.04△△KLF2/β-actin RelA/β-actin 0.60±0.16 0.23±0.04 0.12±0.01** 0.10±0.02**0.44±0.04△△ 0.15±0.02△△

图1 各组中性粒细胞中KLF2和RelA蛋白的表达

表4 各组中性粒细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的比较（x±s）

表4 各组中性粒细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的比较（x±s）

组 别 n空白组 8模型组 8地塞米松组 8 Bax/Bcl-2 3.39±1.24 0.40±0.08**1.14±0.21△△泻肺定喘汤低剂量组 8 0.42±0.04 0.68±0.05 0.62±0.09泻肺定喘汤中剂量组 8 0.45±0.07△△ 0.51±0.07△△ 0.90±0.18△泻肺定喘汤高剂量组 8 0.64±0.08△△ 0.36±0.08△△ 1.91±0.56△△Bax/β-actin Bcl-2/β-actin 0.70±0.08 0.22±0.05 0.31±0.05** 0.79±0.11**0.57±0.07△△ 0.51±0.05△△

图2 各组中性粒细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达

3 结 论

NA作为哮喘的一个独立亚型，是导致患者病情控制不佳、激素治疗反应差的重要原因之一［9］。近年来的研究证实，该病与环境污染、吸烟、肥胖、衰老、急慢性呼吸道感染和大剂量糖皮质激素的应用等有关，并且参与小气道和小血管重构，已成为当前学术界研究的热点［10］。有研究显示，中性粒细胞过量的聚集，与气道中性粒细胞清除受损、凋亡延迟及相关趋化因子的增加有关［11］。活化的中性粒细胞能够分泌炎性因子（如INF-γ、IL-6及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等），同时升高的趋化因子（如白三烯B4及TNF-α等）还能够促进中性粒细胞由循环系统进入肺组织中，加重炎症反应［12］。

KLF-2是锌指Krüppel样转录调节因子家族成员之一，因其最初发现在肺内高度表达，所以命名为肺Krüppel样转录调节因子［13-14］。 近年来的研究发现，KLF-2能够通过抑制转录因子活化蛋白-1和核因子-κB（NF-κB）等信号通路的活化，从而抑制促炎因子的表达、炎症细胞和内皮细胞的活化及炎症细胞的黏附，从而发挥抗炎的作用［15］。 RelA（p65）是 NF-κB 家族成员之一，作为关键的抗凋亡信号和二聚体状态下NF-κB最重要的功能亚基，RelA在中性粒细胞的凋亡中发挥着重要的作用，而KLF-2/RelA的比例失衡能够调控哮喘患者中性粒细胞的凋亡，并且随着病情的加重，KLF-2/RelA 比值逐渐降低［16］。Bax 和 Bcl-2 是目前Bcl-2家族研究较多的凋亡调控基因，其中Bcl-2能够通过阻断凋亡途径，抑制细胞凋亡信号的传导，延长细胞的存活［17］。而Bax作为分子量为21 kDa的蛋白，能够拮抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡，从而起到促进细胞凋亡的作用。因此，调控Bax/Bcl-2之间的平衡在调节细胞凋亡的过程中发挥着重要的作用［18］。

哮喘属于中医学“哮证”的范畴，早在《黄帝内经》中就有关于本病的描述，并称其为“喘鸣”“喘喝”。本病病机以本虚标实为主，其中邪实以痰为宿根，本虚则以肺脾肾脏亏虚为本。因此对于本病急性期，首当以祛邪为主，泻肺定喘汤为笔者所在医院治疗哮喘的经验方，方由定喘汤合泻白散化裁而来，方中麻黄宣肺平喘，白果敛肺祛痰，两者一散一收，既能加强平喘的功效，又能防止麻黄耗伤肺气。杏仁、紫苏子、款冬花、法半夏降气化痰、止咳平喘，在本方中共为臣药。桑白皮、地骨皮、黄芩清肺泄热，止咳平喘，为佐药。炙甘草补脾和胃、调和诸药，为使。全方共奏宣降肺气、清热化痰、止咳平喘的功效。

本研究结果显示，泻肺定喘汤能够显著抑制模型大鼠肺泡灌洗液中白细胞的数量，降低中性粒细胞的比例，增加中性粒细胞的凋亡。另一方面，泻肺定喘汤能够显著增加中性粒细胞中KLF2、RelA和Bax蛋白的表达，降低Bcl-2蛋白的表达，上调KLF-2/RelA和Bax/Bcl-2的比值，与模型组比较差异均具有显著统计学意义，而且泻肺定喘汤的疗效亦呈现一定程度的剂量依赖性。

综上所述，泻肺定喘汤能够降低肺泡灌洗液中白细胞的数量和中性粒细胞的比例，因此我们推断其作用机制可能是通过调控KLF2/RelA的平衡实现的。