麝香通心滴丸对动脉粥样硬化模型大鼠颈总动脉形态及hs-CRP的影响*

陈晶晶 贺 粤 赵东升 周亚滨 孙 静 王淑荣△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.江苏省沭阳县中医院，江苏 沭阳 223699；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 1500400；4.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

冠心病稳定性心绞痛（SAP）发病率与死亡率在逐年上升［1］，防治冠心病刻不容缓。冠心病稳定型心绞痛的发生机制包括很多，其中炎症机制占有主导地位，反应炎症的指标有很多，例如纤维蛋白原和超敏C反应蛋白（hs-CRP）、血清脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）。多年来结合文献与临床研究笔者发现导致胸痹心痛的“瘀”“热”“毒”与炎症因子导致冠心病的现代研究相一致。本实验旨在观察麝香通心滴丸对动脉粥样硬化大鼠模型hs-CRP、Lp-PL-A2的影响，以及动脉粥样硬化大鼠模型颈总动脉的形态学变化，探讨麝香通心滴丸可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 普通级别的SD大鼠80只，均为雄性，体质量180～200 g，大鼠于黑龙江中医药大学实验动物中心购得，生产动物许可证：SYXK（黑）2016-004。大鼠在通风的及定期紫外线照射的环境下喂养，将大鼠分笼，室内物品严格消毒。室内温度控制在（25±1）℃，相对湿度控制在50%～60%。普通饲料组成：碳水化合物60%、蛋白质22%和脂肪10%、其他8%。高脂饲料组成：普通饲料81%、猪油3%、黄15%和胆固醇1%。以上成分混合均匀再进行压粒即可以作为实验动物的饲料。

1.2 药物与试剂 麝香通心滴丸（每丸重35 mg，批号140623），实验前用研钵将药品研成细末，用0.9%氯化钠溶液配成所需浓度，药液浓度为36.5%。瑞舒伐他汀钙片（每片重5 mg，批号H20080240）。实验前用研钵将药品研成细末，用0.9%氯化钠溶液配成所需浓度，药液浓度为8.6%。垂体后叶素（1 mL/支×10支，出厂自南京新百药业有限公司，生产批号H32026638），以上药品都购买自黑龙江中医药大学附属第一医院门诊。Lp-PL-A2测定试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 318W型洗板机，上海三科仪器有限公司；高速离心机，日本日立集团；电子秤，香山EK813股份有限公司；电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.4 造模与分组 60只大鼠参考文献［2］，采用腹腔注射垂体后叶素制备模型。在1周的适应性喂养后，于尾静脉处采血，检测血脂水平有无异常。随机取15只作为空白对照组，将剩余的45只大鼠进行造模每天喂养高脂饲料 （81%普通饲料，3%的猪油，1%胆固醇，15%蛋黄），喂养32 d后，连续3 d予腹腔注射垂体后叶素30 U/（kd·d）。在空白对照组中随机抽取3只大鼠，在进行造模的45只大鼠中随机抽取9只大鼠，用10%水合氯醛（3 mL/kg）进行腹腔内注射以麻醉，静脉采血检验后发现血脂中的低密度脂蛋白与三酰甘油，均较空白对照组增加。取出的颈总动脉，在光镜下显示：不规则动脉管腔及内膜增厚，紊乱的平滑肌排列，弹力膜断裂，泡沫细胞和脂质沉积在管周，细胞轻度炎性浸润，提示造模成功。除去空白对照组及死亡的大鼠，造模成功的大鼠随机分成3组，即模型对照组（n=10）、中药治疗组（n=10）、西药对照组（n=10）。除空白对照组予普通饲料（碳水化合物60%、蛋白质22%、脂肪10%、其他8%）外，其余各组均予高脂饲料（81%普通饲料，3%的猪油，1%胆固醇，15%蛋黄）。

1.5 给药方法 按标准体质量成人（70 kg）、标准体质量大鼠（200 g）及折算系数为0.018按照剂量公式进行剂量换算，具体用药剂量如下，空白对照组：予西药对照组及中药治疗组用药同体积的蒸馏水10 mg/kg，每日1次灌胃。模型对照组：予西药对照组及中药治疗组用药同体积的蒸馏水10 mg/kg，每日1次灌胃。中药治疗组：麝香通心滴丸溶液 10.94 mg/（kg·d）灌胃。 西药对照组：瑞舒伐他汀钙片溶液 0.52 mg/（kg·d）灌胃。持续给药8周，自由进食水。

1.6 标本采集与检测 在第8周后，将各组SD大鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用剪刀剃掉大鼠颈部的毛，常规消毒之后，沿颈总动脉到颈正中线旁3 mm处作1个平行切口（颈动脉切口位置：胸骨与下颌连线），沿着胸骨上7 mm处起，向上垂直延伸约15 mm处切开皮肤，充分暴露颈前肌群，在颈直肌和颈斜肌交叉处，可看见或明显触摸强烈搏动的颈总动脉，随后剥离颈总动脉肌膜，从伴行呈白颜色的神经以及颈静脉中游离出长度大约15 mm的颈总动脉，注意防止损伤神经，之后用线条将远心端结扎，再将近心端动脉用血管钳夹住，在颈总动脉两端的中间插管取血，注意动脉釆血过程中，导管中要注入肝素盐水，肝素浓度推荐为10～15 U/mL。1）取各组大鼠中动脉血，在离心机上以3 600 r/min速度，进行10min分离血清，再采用乳胶凝集比浊法，对hs-CRP进行测定。2）按试剂盒说明，采用双抗体夹心法检测标本中Lp-PL-A2水平。用纯化的Lp-PL-A2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入Lp-PLA2，再与HRP标记的Lp-PL-A2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体的复合物，在彻底洗涤之后加入TMB显色。HRP酶催化底物TMB使之变为蓝色，与此同时酸将底物TMB变为黄色。颜色的深浅和标本中的大鼠Lp-PL-A2呈正比。用酶标仪在450 nm波长处读吸光度（OD值），用标准曲线计算样品中Lp-PL-A2浓度。3）剥离出颈总动脉，将上面残血用0.9%氯化钠注射液洗净，再用10%的多聚甲醛溶液使标本牢固，用乙醇逐级脱水，覆盖石蜡进行包埋切片，参照常规方法用HE进行染色来观察颈总动脉内膜的情况。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间采用t检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比较 见表1。与模型对照组相比，空白对照组、中药治疗组、西药对照组血清hs-CRP水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与西药对照组相比，中药治疗组血清hs-CRP水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型对照组相比，空白对照组、中药治疗组、西药对照组Lp-PLA2水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与西药对照组相比，中药治疗组Lp-PL-A2水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比较（x±s）

表1 各组大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比较（x±s）

与模型对照组治疗后比较，△P＜0.05

组 别 n Lp-PL-A2（μg/L） hs-CRP（mg/L）空白对照组 10 6.19±2.56△ 1.76±0.45△模型对照组 10 12.60±4.74 4.30±0.86中药治疗组 10 7.11±2.83△ 2.80±0.73△西药对照组 10 6.85±2.38△ 2.70±0.53△

2.2 各组大鼠颈总动脉病理形态观察 见图1。空白对照组大鼠颈总动脉结构完整，具有清楚的层次，有光滑、连续，的内膜，中层的平滑肌层分布均匀没有萎缩，动脉管腔近圆形，有不规则增厚，弹力膜较清晰，局灶平滑肌排列紊乱，轻度肿胀；模型对照组的动脉血管壁内皮脱落，内膜有明显的增厚，内皮下的间隙增宽，内弹力板断裂，中膜平滑肌有明显萎缩，管周有泡沫细胞和脂质沉积，炎细胞轻度浸润；中药治疗组的内皮细胞有部分的脱落，结构较完整，只有少量的脂质沉积，并且内弹力板断裂少见；西药对照组主动脉壁结构镜下显示与麝香通心滴丸组相似。

图1 对动脉粥样硬化大鼠颈总动脉病理形态（HE染色，200倍）

3 讨 论

3.1 麝香通心滴丸组方分析及现代药理研究 麝香通心滴丸主要成分为人工麝香、人参、蟾酥、丹参、人工牛黄、熊胆粉和冰片［3］。方中麝香、蟾酥为君，活血止痛；人参茎叶总皂苷、丹参为臣，补气活血，与麝香、蟾酥配伍以行气血不畅之标，补心气不足之本；佐以人工牛黄、熊胆清热解毒、豁痰开窍；冰片为使，与麝香等配伍，增强清热开窍止痛之功。总览全方，补气活血止痛，清热化痰开窍，标本兼顾。本研究结果表明，麝香通心滴丸能够减低动脉粥样硬化大鼠hs-CRP及抑制Lp-PL-A2，同时保护心肌细胞不受损害，所以我们认为它的机制可能是因为麝香通心滴丸发挥活血清热、化痰开窍的功效，活血化痰清热，病邪乃去，则能治疗动脉粥样硬化。现代药理研究显示麝香可以抑制氧自由基和脂质过氧化，具有增强心肌收缩力，增大收缩幅度，改善内皮功能等作用，对心肌起到保护作用［4-5］。现代药理研究表明人参能抑制心肌肥厚，增加血流量，营养心肌，人参皂苷能降低游离钙离子，促进一氧化氮、环磷鸟苷的生成舒张血管［6-7］。蟾酥能保护心肌，降低心肌收缩力，其有效成分蟾酥灵能抑制钙诱导钙释放［8］。丹参能保护内皮细胞，提高SOD活性，减少细胞凋亡，调节OX40/OX40L信号通路抗动脉粥样硬化［9-10］。人工牛黄对心衰模型心脏有正性肌力作用，其主要成分牛磺酸可以抑制血小板凝集、血栓的生成保护心肌、抗心力衰竭［11-12］。熊胆粉能ECV304细胞的损伤，其有效成分熊去氧胆酸及牛磺鹅去氧胆酸能保护血管内皮细胞［13］。冰片能够抑制炎性因子的表达，减轻炎症反应，控制血栓的形成［14］。

3.2 麝香通心滴丸对hs-CRP及Lp-PL-A2表达的影响 hs-CRP是一种重要的微量蛋白质分子，它由肝脏合成、释放，是判断炎症反应急性期的重要指标［15］。hs-CRP与病情轻重呈正相关，所以检测hs-CRP对各种炎性疾病、机体受到创伤及心血管疾病有重要的价值［16］。Lp-PL-A2也是近年来备受热议的炎症标志物，它又称为血小板活化因子乙酰水解酶，可催化脂蛋白和细胞膜上的甘油磷脂二位酰基酯键水解，最终形成非酯化脂肪酸及溶血磷脂［17］，这两种物质均是促炎促凋亡的脂质调节物，介导炎症细胞聚集至血管内皮细胞下，促使白细胞黏附因子等多种炎症因子的表达，损伤动脉内膜，促进并参与动脉粥样硬化的发生和发展［18］。本研究结果表明，麝香通心滴丸能明显抑制动脉粥样硬化大鼠心肌组织hs-CRP及Lp-PL-A2的表达，抑制炎性反应，治疗动脉粥样硬化，其与瑞舒伐他汀疗效相当。

3.3 麝香通心滴丸对颈总动脉形态的影响 颈动脉因其解剖位置表浅，利于取材观察，并且它病变的程度和冠状动脉平行，已经成为临床观察外周动脉的首选指标［19］。颈动脉结构主要改变有二，一为颈动脉内膜中膜复合体厚度（IMT）增厚，二为斑块形成，其常常作为最重要的评价动脉粥样硬化严重程度的指标之一，冠心病患者颈动脉IMT及斑块指数比健康人群明显升高［20］，并且冠状动脉病变程度越重，则颈动脉IMT及斑块指数越高。本研究通过光镜观察颈总动脉形态，一方面为了判定动脉粥样硬化模型复制是否成功，高脂饲料喂养32 d后，腹腔注射垂体后叶素3 d，采血测低密度脂蛋白、三酰甘油，在光镜下颈总动脉显示不规则动脉管腔及内膜增厚，泡沫细胞和脂质沉积在管周，细胞轻度炎性浸润，认为本研究注射垂体后叶素的方法能成功复制动脉粥样硬化模型。另一方面判定给药8周后麝香通心滴丸组和瑞舒伐他汀组动脉粥样硬化大鼠的疗效，结果通心滴丸组、瑞舒伐他汀组大鼠颈总动脉脂质沉积及内弹力板断裂明显减少。

总之动脉粥样硬化模型大鼠在进行麝香通心滴丸灌胃后hs-CRP与Lp-PL-A2降低，颈总动脉组织光镜下的改变，可表明麝香通心滴丸可抑制炎性反应，延缓动脉粥样硬化的进程，其疗效与瑞舒伐他汀相当。