清热活血方对心梗后心室重构的作用及对多胺相关蛋白ODC、SSAT表达的影响*

赵新军 李 荣 吴 伟 卿立金 罗川晋 褚庆民 李 靖 都治伊 邱艺俊

（广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405）

心梗后心室重构（VR）是指急性心肌梗死（AMI）后心脏在受到损伤状态下，出现心肌细胞适应不良性肥大、心肌细胞凋亡和心肌细胞外基质纤维化，引起心室形态、结构及功能等发生一系列的改变［1-2］。VR的进一步发展是并发心衰甚至心源性死亡的最重要的因素之一。多胺是一组脂肪胺类小分子化合物，由腐胺（putrescine）、精脒（spermidine）、精胺（spermine）组成，在细胞生长、发育及分化中发挥作用。心肌梗死后神经内分泌的过度激活是导致VR的主要原因［3］，而神经内分泌的过度激活则可以引起多胺代谢平衡的严重紊乱。证据表明，多胺在心脏疾病的各个方面起着重要的作用［4］。

本课题组在临床工作中总结出AMI发生的主要病机可能是热毒血瘀［5］，提出了“清热活血”的治疗原则，并由此在陈可冀院士冠心2号方基础上创立了清热活血方。研究表明，清热活血方能改善AMI后患者的临床证候积分［6］，能改善梗死后左室结构和功能［7］。既往清热活血方主要侧重于临床疗效研究，本实验侧重基础研究，观察清热活血方对多胺及其相关蛋白的影响，从而探索清热活血方改善心肌梗死后VR的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠70只，质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，广东省实验动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0034。大鼠生活在无致病菌的环境中，大鼠可在恒温20～22℃的房间内自由取水，并有12 h∶12 h的光-暗循环。所有涉及实验动物的程序都是按照广州中医药大学动物保护和使用机构委员会的指导方针进行的。在进行实验前，允许大鼠适应新环境1周。

1.2 试药与仪器 1）试药：腐胺（上海亨代劳仪器有限公司，批号333-93-7）、亚精胺（又名精脒，上海亨代劳仪器有限公司，批号124-20-9）、精胺（上海亨代劳仪器有限公司，批号71-44-3）、鸟氨酸脱羧酶抗体（santa cruz公司）、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶抗体（santa cruz公司）。培哚普利（施维雅制药有限公司，批号 H20034053）；2）仪器：心脏彩超机（飞利浦 IE33，德国飞利浦公司）、小型动物呼吸机型号（SAR-830，上海寰熙医疗）。

1.3 模型制备 随机选取60只大鼠进行心梗造模。方法参照文献并适当改进［8］。以100 g/L水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/100 mg）麻醉大鼠。左侧胸部备皮，大鼠固定于弓形木板上，充分暴露颈部气管，使用激光笔照射大鼠颈部，采用自制的导管经口气管插管，成功后接呼吸机，采用容量控制模式，潮气量约3 mL/100 g，频率为75次/min，观察大鼠胸廓起伏，并微量调整呼吸机参数。呼吸稳定后，沿左侧胸部第3、4肋间开胸，暴露心脏，撕开心包膜，棉签拨开胸腺和左心耳，左冠状动脉起源点下1～2 mm处，使用6-0无损伤缝线在肺动脉圆锥与左心耳之间缝扎冠状动脉左前降支。结扎后连接心脏电生理记录仪。心肌梗死成功的标志为：标准肢体导联Ⅱ导ST段抬高，肉眼观察结扎区变白或变灰色，迅速将心脏放回胸腔，随即分层缝合肌肉和皮肤，将胸腔内的空气及血液抽尽，并给予术口消毒。术后每隔15 min复查一次心电图，如连续2次ST段抬高即为AMI造模成功。假手术组缝线仅穿过冠状动脉而不结扎，其余操作与AMI模型组动物相同。术后予青霉素8万U，肌肉注射，每日1次，共3 d。随机选取60只大鼠进行心梗造模。造模1周后行心脏彩超检查。

1.4 分组方法 排除造模不成功的大鼠6只，以及1周内死亡的4只，将剩余50只造模成功的大鼠随机分成5组，每组10只，另设假手术组，共6组，包括假手术组、模型组、培哚普利组、清热活血方高剂量组、清热活血方中剂量组、清热活血方低剂量组。

1.5 干预方法 清热活血方及培哚普利均为根据成人剂量计算得到的大鼠1倍生物等效剂量。清热活血方的制备及质量控制：川芎、赤芍、降香、红花、丹参、黄芩、毛冬青，按照 10∶12∶10∶10∶30∶15∶30 的比例。 将药物置于砂锅中，加入相当于药材体积8倍量的水浸泡2 h，煮沸30 min，过滤药液；再加入5倍量的水继续煮沸20 min，过滤，合并两次滤液，将药液浓缩至含生药浓度1 g/mL，4℃保存备用。培哚普利组灌胃浓度0.41 mg/kg，清热活血方高剂量组灌胃浓度 30 g/（kg·d），清热活血方中剂量组灌胃浓度15 g/（kg·d），清热活血方低剂量组灌胃浓度7.5 g/（kg·d），每日分2次灌胃。假手术组和模型对照组给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃，连续给药8周。

1.6 标本采集与检测 1）心脏超声动态观察大鼠心脏结构变化。于术后第8周检测多普勒超声心动图，探头频率为12 MHz，采用标准的左室长轴切面，同时记录心电图，观察心脏的形态、室壁运动幅度［9］。2）采用高效液相色谱法检测心肌组织多胺的含量：色谱条件和质谱条件参考相关文献并适当改进［10］。（1）微透析样品的前处理：各组动物均给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打开胸腔取出心脏，在冷的0.9%氯化钠注射液中漂洗、拭干。快速取左心室150～200 mg，加入0.3 mmol/L冷的高氯酸，在冰水浴中制成匀浆，然后3 500 r/min离心15 min，取其上清液贮存在-80℃冰箱保存。 （2）微透析样品的处理：微透析样品（100 μL）置1.5 mL具盖聚乙烯管中，依次加入IS溶液（100 μg/mL）100 μL，加入 1 mL 乙醚，涡旋 30 s，在 13 000 r/min 离心15 min。取上层有机相，于40℃下氮气吹干，残渣以200 μL 甲醇-水溶液（90∶10，v/v）复溶，涡旋 30 s，取5 μL进行UFLC-MS/MS分析。（3）色谱条件和质谱条件。色谱条件：Agilent Zorbax XDB-C8色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）。 流动相：甲醇-水（90∶10，v/v），流速0.2 mL/min，柱温为室温。 进样量：5 μL。 质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子扫描方式及多离子反应检测（MRM）方式检测，喷雾电压为5 500 V，温度为600℃，气帘气20 psi。腐胺、精脒、精胺均选取两对离子对，内标选取一对离子对。（4）储备液和标准工作液。腐胺、精脒、精胺和内标的储备液用甲醇配制，分别含腐胺、精脒、精胺 10.0 μg/mL，内标 1.0 μg/mL。 工作液由乙醚稀释各物质的储备液制备，储备液储存于-80℃冰箱，工作液储存于4℃冰箱。3）检测多胺系统相关蛋白鸟氨酸脱羧酶（ODC）、精脒/精胺乙酰基转移酶（SSAT）的表达。取冻存的心肌组织0.5 g加入1 mL蛋白裂解液 （50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1%SDS，25 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na3VO4，100 mg/L PMSF，2 μg/mL leupeptin，1 μg/mL aprotinin），匀浆，离心，取其上清液，分装保存于-80℃冰箱。Bio-Rad法测定上清液中的蛋白质浓度，加入上样缓冲液 （50 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，2%SDS，10%glycerol，2% β-mercaptoethanol 和 0.5‰ bromophenol blue），10%SDSPAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜，1×TBS液洗涤3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗涤3次。ECL化学发光试剂盒显色，KODAK Image Station 4000 MM图像系统曝光，分析条带面积，读取宽度和灰度值，最后做统计分析。4）大鼠生存时间的计算。大鼠生存时间以入组后药物开始干预当天为准，记录大鼠存活时间，以天数为单位。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，各组均数比较使用 one-way ANOVA。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠生存时间比较 见表1。8周后，假手术组无死亡，模型组死亡5只，死亡率达50%。培哚普利组、清热活血方高剂量和中剂量组分别死亡1只，占10%。低剂量组死亡3只，占30%。各组生存时间比较差异有统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠生存时间比较（d，x±s）

表1 各组大鼠生存时间比较（d，x±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组 别 n假手术组 10模型组 5培哚普利组 9生存时间56.00±0.00△△33.40±24.47**51.40±14.55△△清热活血方高剂量组 9 54.00±6.32△△清热活血方中剂量组 9 54.40±5.06△△清热活血方低剂量组 7 43.20±21.71*

2.2 干预后各组大鼠心功能比较 见表2，图1。8周后，通过心脏彩超评估了各组大鼠的心功能情况。同假手术组对比，模型组心功能显著下降，表现为左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）显著降低（P＜0.001 或P＜0.001），左室舒张末内径（LVEDd）和左室收缩末内径（LVEDs）显著增大（P＜0.001，P=0.001）。与模型组比较，清热活血方明显改善了MI后心衰大鼠的心功能。

表2 各组大鼠干预后心功能比较（x±s）

表2 各组大鼠干预后心功能比较（x±s）

组 别 n假手术组 10模型组 5培哚普利组 9 LVEDd（mm）LVEDs（mm） LVEF（%） LVFS（%）6.23±0.57△△ 3.12±0.44△△ 70.67±7.97△△ 39.22±3.21△△9.97±0.85** 7.58±1.51** 33.18±8.48** 15.00±4.82**7.62±0.61**△ 4.21±0.58*△△ 59.71±12.46**29.21±6.81**△△清热活血方高剂量组 9 7.42±1.05**△ 4.01±1.02*△△ 53.13±8.39*△△ 28.41±5.56**△△清热活血方中剂量组 9 7.95±1.41**△ 5.14±0.86** 45.62±9.8**△△ 25.28±7.95**△△清热活血方低剂量组 7 8.07±1.40**△ 6.54±1.82** 37.41±8.7**△ 24.82±6.71**△△

图1 各组左心室的二维心脏彩超显像（成像频率，12 Hz）

2.3 各组大鼠左室非梗死区心肌组织中多胺系统相关蛋白ODC、SSAT表达的比较 见表3，图2。与假手术组对比，模型组中ODC和SSAT蛋白表达均有增强；同模型组对比，培哚普利和清热活血方不同浓度组均能降低ODC的表达，差异有统计学意义 （P＜0.05）。 同时，清热活血方治疗组也增强了SSAT蛋白表达，在高剂量组和中剂量组中有统计学意义 （P＜0.05），低剂量组中无统计差异（P＞0.05）。结果提示：清热活血方可抑制心肌梗死后ODC的高表达，进一步增强SSAT的表达，从而抑制多胺的合成，促进精脒和精胺的进一步分解，减少总多胺池的含量。

表3 各组左室非梗死区心肌组织中ODC和SSAT比较（%，x±s）

表3 各组左室非梗死区心肌组织中ODC和SSAT比较（%，x±s）

组 别 n假手术组 10模型组 5培哚普利组 9清热活血方高剂量组 9清热活血方中剂量组 9清热活血方低剂量组 7 ODC SSAT 1.02±0.16△△ 1.07±0.20△△3.57±0.82** 2.16±0.30**1.14±0.28*△△ 3.62±0.63*△△1.14±0.24*△△ 3.48±0.60*△△1.31±0.41*△△ 2.28±0.49*△△2.15±0.46**△△ 2.15±0.30**△△

图2 各组左室非梗死区心肌细胞ODC和SSAT蛋白表达

2.4 各组左室非梗死区心肌组织中多胺含量比较见表4。8周后，与假手术组比较，心肌梗死心衰模型组大鼠的左室非梗死区心肌细胞内多胺含量仍有较高水平，腐胺、精脒及精胺含量均有增高（均P＜0.001），其中，腐胺含量为假手术组的4倍左右，精脒含量为假手术组的3倍左右，精胺含量为2倍左右，总多胺池水平也明显增加（P＜0.05）。清热活血方腐胺、精脒及精胺的含量显著降低，有浓度依赖趋势。结果：清热活血方干预后，腐胺、精脒、精胺和总多胺水平均显著下降。

表4 各组左室非梗死区心肌组织中多胺含量比较（μg/g，x±s）

表4 各组左室非梗死区心肌组织中多胺含量比较（μg/g，x±s）

组 别 n假手术组 10模型组 5培哚普利组 9腐胺 精脒 精胺 总多胺0.59±0.11△△ 48.91±6.33△△ 37.08±7.63△△ 86.58±14.07△△2.16±0.32** 145.82±8.28** 85.92±2.84** 233.97±60.81**0.89±0.16*△△ 63.99±5.89*△△ 48.21±5.79*△△ 110.69±27.95**△△清热活血方高剂量组 9 1.37±0.21**△△ 79.29±13.36**△△ 66.12±7.86**△△ 145.92±36.04**△△清热活血方中剂量组 9 1.40±0.26**△△ 59.50±8.17**△△ 72.60±2.34**△△ 163.49±13.06**△△清热活血方低剂量组 7 1.85±0.19**△ 110.88±18.35**△△ 75.89±9.61**△ 186.87±48.10**△

3 讨 论

当前，VR被认为是慢性心力衰竭发生发展的主要病理基础，早期有效地延缓和逆转心梗后VR有着重要的临床意义。目前，国内外对药物干预心肌梗死后VR的发生进行了大量的实验研究，作用机制的研究已深入到分子细胞水平，为临床用药提供了许多循证医学证据，但VR发生的机制相当复杂，故临床上的治疗仍面临许多挑战。中医在改善VR方面为循证医学提供了较好的补充依据，临床上补充了西医的不足。

课题组根据国家中医药管理局“十一五”重点专科重大疾病诊疗方案中“热毒”证素辨证标准发现岭南地区AMI患者多具有“口气秽臭、口干口苦，烦热，大便秘结，舌紫暗或暗红，苔黄厚腻，脉弦，滑或滑数”等热毒证候表现，统计显示热毒证候表现的患者达59.9%，表明AMI发生的主要病机可能是热毒血瘀［5］。因此，课题组提出了“清热活血”的治疗原则，并创立了清热活血方。近年来，胸痹心痛和真心痛的热毒血瘀病机和清热解毒、活血化瘀法的应用逐渐受到临床医师的重视，为治疗VR提供了新的思路。

多胺是一种带有氨基的脂肪胺类物质，包括腐胺、精脒、精胺，参与体内多种重要的生理和病理过程，在细胞凋亡的调节、酶功能及环磷酸核苷代谢等方面起着重要的作用［11］。ODC是多胺合成的关键酶，经过该酶的催化，鸟氨酸脱羧基形成腐胺，后者是动物细胞合成多胺的限速酶。SSAT为多胺分解代谢的限速酶，具有催化精胺逆转化为精脒以及精脒逆转化为腐胺的作用［12］。研究表明，多胺不仅在孕体发育、抗衰老、肿瘤以及脑缺血的发生发展等方面有重要作用［13］，而且在心血管疾病方面也有明显的进展。多胺在心室重构的发生发展过程中也发挥了重要作用。已有研究提示了多胺和心肌肥大之间的关系，证实在肥大心肌细胞的动物模型中，心肌细胞内均有ODC活性的高表达和多胺的过度聚集［14］。用ODC抑制剂抑制多胺合成，可以通过减缓异丙肾上腺素诱导的CPK和LDH释放，从而缓解VR［15］；也有研究表明，在缺血性心脏病导致的心衰患者中，多胺可能是导致心肌纤维化的重要促发因素［16］。由此可见，在心肌梗死后VR的演变过程中，多胺可能是神经内分泌系统激活导致VR的共同通路。

本实验中，笔者检测了左室非梗死区心肌细胞内多胺的含量，发现AMI心衰模型组大鼠的心肌细胞内多胺含量明显偏高，腐胺、精脒、精胺以及总多胺池水平也明显增加。与心衰模型组比较，培哚普利组、清热活血方各浓度组腐胺、精脒及精胺的含量均有不同程度降低，其中高剂量组和中剂量组多胺水平降低明显，提示清热活血方有降低VR进展中多胺水平的作用。Western blotting法检测了心肌组织中ODC、SSAT蛋白的表达发现：模型组中ODC和SSAT蛋白的表达均明显增强，而培哚普利组和清热活血方治疗均可以抑制ODC蛋白的表达，减少多胺的合成，同时清热活血方干预还可以增强SSAT蛋白的表达，加速多胺进一步降解。通过实验，我们初步得出结论：清热活血方可以调节心梗后VR过程中的多胺系统，其抗VR的作用可能是通过对多胺及其相关蛋白的调节来实现的。但多胺成分复杂，每一种胺类在VR中的作用机制和表达情况又不尽相同，如有文献报道缺血再灌注损伤时ODC过度表达，腐胺含量增加可减少转基因小鼠和大鼠的梗死面积，具有“双刃剑”作用［17］。 因此，清热活血方通过多胺系统对心梗后VR的改善作用还需要进一步的细化研究。