PH-START1调控拟南芥发育的功能分析

赵亚卓，王 鑫，冯佳佳，孙丹丹，王凤茹，董金皋

(河北农业大学 生命科学学院，河北省植物生理和分子病理学重点实验室，河北 保定 071001)

START(The lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains)结构域广泛存在于动物、植物和微生物中，此结构域调控着磷脂运输和脂质代谢。在人类和动物很多蛋白质中含有START结构域，与疾病的发生密切相关；在植物中START结构域往往和其他植物特有的结构域同时存在于一个蛋白质中，调控着植物各个生长发育过程，如ATML1(A.thalianaMERISTEM LAYER1)在皮层的发育过程中起重要的调控作用[1]，PDF2(PROTODERMAL FACTOR2)可调控花器官的形成[2]，GL2(GLABRA2)调控表皮毛的生长[3]。ATML1、PDF2和GL2均属于START结构域蛋白家族中的HD-ZLZ START(Homeodomain zipper-loop-zipper StAR-related lipid transfer)亚家族，这类亚家族成员属于转录因子，START结构域在这些转录因子中的作用类似于动物中的甾醇类激素受体，通过结合脂类或甾醇类物质来调控转录过程。拟南芥中含START结构域家族成员共35个，但已知功能的仅有9个，均为转录因子家族[4]。在START结构域家族中，还有PH-START(Pleckstrin homology StAR-related lipid transfer)亚家族，但此亚家族成员在调控植物生长发育方面的功能还未见报道。

拟南芥中PH-START蛋白亚家族由At4g19040、At5g45560、At3g54800、At2g28320 4个成员组成。除有研究发现At4g19040突变体可增强拟南芥对白粉菌(Erysiphecichoracearum)的抗性外[5]，此亚家族成员对拟南芥生长发育的调控作用未见报道。PH(Pleckstrin homology)结构域首先在普雷克底物蛋白中识别，大约含有120个氨基酸残基，是血小板中蛋白激酶C(PKC)的主要底物[6-7]。PH结构域是很多与细胞膜结构结合的第二信使蛋白质所具有的结构域。已证实PH结构域参与了细胞内信号传导、细胞骨架组成、膜磷脂的转运和修饰[8-9]。在人类基因组中，已经发现了252 种蛋白质含有不同结构的PH结构域[10]，在酿酒酵母中，有33种蛋白质具有不同结构的PH结构域[11]。迄今为止，一些PH结构域的结构已经通过核磁共振和X射线获得，尽管不同PH结构域之间的序列相似性很低，但其三维结构却具有显著的保守性[12]。虽然已经在不同基因组中识别了大量的PH结构域，但PH结构域的功能尚不清楚[13]。PH结构域首次被识别时，认为是一个蛋白质结合域，并且可以识别蛋白质配体，例如异源三聚体G蛋白的β/γ亚基、WD40重复蛋白和酪氨酸激酶等[14]。然而，PH结构域最显著的功能是它们与磷脂(例如磷酸肌醇或肌醇磷脂酸)结合的能力[15]，与磷酸肌醇类物质的结合可以使具有PH结构域的蛋白质对脂类细胞信使做出反应，从而转移至细胞膜结构上。蛋白磷脂酶C(PLC)家族具有PH结构域，PLC酶是存在于胞浆膜上的一个关键酶，可以水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)，产生1,4,5-磷酸三肌醇和二酰甘油2个第二信号分子，调节细胞内的Ca2+释放和激活蛋白激酶C[15]。

本研究以PH-START亚家族成员At2g28320(命名为PH-START1)作为研究对象，分析其时空表达特性，探究其在拟南芥生长发育中的作用，为更好地促控植物生长发育、提高作物产量提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)：Columbia(Col-0)，由河北农业大学植物生理和分子病理学重点实验室种植；拟南芥PH-START1(At2g28320)基因的T-DNA插入突变体(SALK-060171、SALK-120376)，购自美国ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)突变体库。拟南芥生长培养条件为：温度22 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。

1.2 试验方法

1.2.1PH-START1基因表达量分析 为研究PH-START1基因在拟南芥的时空表达情况，以Col-0野生型为材料，分别以根、茎、不同位置的莲座叶、不同花期的花、授粉后不同时间的角果为材料，提取总RNA，经反转录后，利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表达情况。

1.2.2PH-START1过表达转基因拟南芥的获得 以PH-START1基因的CDS序列和拟南芥过表达载体pSN1301的MCS分析其酶切位点并选定为BamH Ⅰ和KpnⅠ，以野生型拟南芥的cDNA作为模板，扩增PH-START1目的序列。对PCR扩增得到的目的片段经胶回收后与克隆载体pMD19-T Vector连接，转化大肠杆菌，对筛选得到的阳性克隆菌液检测并测序，将测序正确的菌液提取质粒，双酶切回收目的条带，然后与载体片段连接、转化、验证。将最终得到的含有目的基因的过表达载体命名为pSN1301-PH-START1。用电击法转化农杆菌GV3101，利用花絮侵染法转化野生型拟南芥，抗生素筛选阳性苗[16]，并用Real-time PCR进行基因表达量的验证。

1.2.3PH-START1T-DNA插入突变体的获得 将购买的PH-START1基因突变体种子播种在含有Kan抗性的MS平板上(Kan：100 mg/L)筛选，选取叶片鲜绿下胚轴较长的植株移栽，收获种子继续筛选并进行验证。

三引物法：提取T3不再出现分离的突变体植株幼苗和野生型拟南芥的DNA，以T-DNA Primer Design(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html)设计插入位点上下游的引物LP、RP，以LBb1作为T-DNA特异引物，通过琼脂糖凝胶电泳验证T-DNA插入位点。

PH-START1基因表达量验证：提取28 d的Col-0野生型拟南芥和PH-START1突变体植株的RNA，反转录后用SqRT-PCR和Real-time PCR 验证PH-START1基因的表达情况。

1.2.4 拟南芥叶面积的测定 将生长环境完全一致的野生型和突变体植株相同部位的叶片展平，用Image J软件测量叶片的面积，野生型和突变体各测量30个叶片。

2 结果与分析

2.1 PH-START1时空表达分析

分别提取野生型拟南芥不同生长时期的根、茎、莲座叶、花、角果的总RNA并反转录，然后利用Real-time PCR分析PH-START1基因的表达量(图1)。结果发现，在拟南芥的各个器官中均有PH-START1基因的表达，在叶中表达最多，然后依次是根、花、角果和茎，且在各个器官中的表达差异达极显著水平(图1-A)；从子叶期到幼苗期，根中PH-START1基因的表达量极显著上升，但到成苗期根中PH-START1的表达无显著改变(图1-B)；对第2，4，6，8，10片莲座叶中PH-START1的表达分析发现，每片莲座叶中均有PH-START1的表达，在第6片莲座叶中的表达量最高，其次是第2片莲座叶，在第8，10片莲座叶中表达量最低(图1-C)；授粉后的角果中PH-START1均有表达，授粉后第5天(5DAP)的角果中PH-START1表达量极显著高于3 d的角果，而在以后时期角果的表达量更低(图1-D)；比较不同花期的花中PH-START1表达量，发现随着花的发育，花中PH-START1表达量逐渐增高，差异均达极显著水平(图1-E)；比较花器官中花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊PH-START1基因的表达情况，发现雄蕊中PH-START1的表达量最高(差异极显著)、其次是花瓣和萼片，而雌蕊中最少，差异达极显著水平(图1-F)。

不同小写和大写字母分别表示5%和1%水平差异显著。图9同。Different small and capital letters indicate 5% and 1% significant level respectively.The same as Fig.9.

2.2 PH-START1过表达载体的构建

根据PH-START1CDS序列引物扩增得到PH-START1CDS序列，经琼脂糖凝胶电泳检测，在2 214 bp处得到单一条带，与PH-START1片段大小一致(图2-A)。回收目的条带，并与克隆载体pMD19-T vector 16 ℃连接1 h，转化E.coliDH5α，PCR检测阳性菌落(图2-B)。选择阳性克隆进行测序，并提取测序正确的阳性克隆质粒，用BamH Ⅰ和KpnⅠ对其双酶切(图2-C)，回收目的片段。目的片段与pSN1301载体片段用T4DNA Ligase在16 ℃过夜连接，转化E.coliDH5α后对阳性克隆进行PCR检测(图2-D)。将阳性克隆用BamH Ⅰ和KpnⅠ进行双酶切验证，得到PH-START1目的条带(图2-E)，表明PH-START1过表达载体构建成功，命名为35S∶pSN1301-PH-START1。将构建好的35S∶pSN1301-PH-START1转化GV3101，用基因序列引物检测阳性克隆，得到PH-START1基因目的条带(图2-F)，说明构建好的过表达载体成功转入农杆菌感受态GV3101中。

A.PH-START1基因扩增；B.阳性克隆PCR检测；C.pMD19-PH-START1双酶切验证；D.pSN1301-PH-START1的PCR检测；E.35S∶pSN1301-PH-START1双酶切验证；F.35S∶pSN1301-PH-START1转化GV3101后PCR检测。M.5 kb Marker；1-3.目的条带。

A.PH-START1gene amplification; B. Positive clone detection by PCR; C.pMD19-PH-START1double enzyme digestion test; D. pSN1301-PH-START1PCR detection; E.35S∶pSN1301-PH-START1double enzyme digestion test; F.PCR detection of pSN1301-PH-START1transformation into GV3101. M. 5 kb Marker; 1-3. Target band.

图2PH-START1过表达载体的构建
Fig.2 Construction ofPH-START1overexpressing vector

2.3 过表达PH-START1转基因拟南芥的遗传转化和筛选

用花絮侵染法转化拟南芥，将转化得到的种子经抗性筛选(图3-A)，得到T3纯合株系，提取纯合株系DNA，可以扩增出目的条带(图3-B)，说明过表达PH-START1转基因拟南芥创制成功。

2.4 过表达拟南芥植株中PH-START1的表达量分析

为了解PH-START1过表达拟南芥中PH-START1的表达情况，从得到的阳性植株中选取了2个转基因株系提取总RNA，反转录后对PH-START1基因进行SqRT-PCR分析(图4)，结果发现2个转基因植株中pH-START1的表达量均高于野生型植株，表明确实为PH-START1过表达株系，将其分别命名为OE1、OE2。

A.潮霉素平板上转基因阳性苗的筛选；B.PCR检测35S∶pSN1301-PH-START1转基因阳性纯合株系。M.2 kb Marker；1-2.WT对照；3-4.目的条带。

A.Screening of transgenic positive seedlings on the hygromycin plate; B.PCR detection of the35S∶pSN1301-PH-START1transgenic positive homozygous lines. M.2 kb Marker;1-2.Control;3-4.Objective stripe.

图3 过表达PH-START1转基因阳性苗的筛选与纯合验证
Fig.3 Screening and homozygous validation of35S∶pSN1301-PH-START1overexpression transgenic positive seedlings

2.5 PH-START1缺失突变体转基因拟南芥的创制

2.5.1PH-START1T-DNA插入突变体插入位点分析 由ABRC突变体库购得拟南芥PH-START1的2株不同T-DNA插入位点突变体，其编号分别为SALK_060171、SALK_120376。通过拟南芥数据库TAIR网站，得到其插入位点(图5)，箭头所指的位置及方向就是载体插入的位置及方向。SALK_060171插入位置在起始密码子ATG后205 bp的位置，将之命名为ph-start1-1，SALK_120376插入位置在起始密码子ATG前534 bp的位置，将之命名为ph-start1-2，背景为 Col-0 野生型拟南芥。

图5 ph-start1突变体中T-DNA插入位点示意图Fig.5 The T-DNA insertion sites in ph-start1 mutant

提取T3不再出现分离比的突变体植株幼苗和野生型拟南芥的DNA，以T-DNA Primer Design设计插入位点上下游的引物LP、RP，以LBb1作为T-DNA特异引物，通过琼脂糖凝胶电泳验证T-DNA插入位点。结果表明(图6)，ph-start1-1和ph-start1-2株系为T-DNA插入突变体纯合株系。

M.2 kb Marker；1.以LBb1和RP为引物；2.以LP和RP为引物。M.2 kb Marker; 1.LBb1 and RP as primers; 2.LP and RP as primers.

2.5.2 T-DNA插入突变体中PH-START1的表达量分析 为了解PH-START1T-DNA插入突变体中PH-START1表达情况，提取野生型拟南芥和ph-start1突变体幼苗RNA，用SqRT-PCR技术分析PH-START1基因的表达情况(图7)，结果表明ph-start1-1和ph-start1-2无PH-START1表达，说明确实为PH-START1功能缺失突变体。

图7 SqRT-PCR技术分析PH-START1 T-DNA插入突变体中PH-START1的表达量Fig.7 Expression analysis of PH-START1 by SqRT-PCR in PH-START1 T-DNA insertion mutants

2.6 PH-START1 转基因拟南芥表型分析

将收获的Col-0野生型拟南芥、PH-START1-OE、缺失突变体拟南芥种子播种在培养基中，放置于培养室相同环境下培养，观察各时期生长发育情况(图8)。发现播种12 d，Col-0野生型拟南芥为四叶期而OE转基因拟南芥已到达六叶期，OE植株明显较野生型大；播种25 d，OE生长发育已变得迟缓，植株明显小于野生型；播种40 d，OE转基因拟南芥各个器官的生长发育都明显小于野生型。ph-start1无论是在四叶期还是在营养生长时期的生长发育都略优于野生型。综上所述，PH-START1对拟南芥的生长发育起着重要的调控作用。

A.拟南芥四叶期植株表型对比(播种12 d)；B.拟南芥四叶期植株表型对比(播种10 d)；C-D.在同样正常的环境条件下，Col-0野生型和OE表型对比(播种25 d)；E.Col-0野生型和ph-start1表型对比(播种30 d)；F.Col-0野生型和OE表型对比(播种40 d)。

A.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(12 d after sown); B.Phenotypic comparison of 4-leaf stage ofArabidopsis(10 d after sown); C-D.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(25 d after sown) under the same normal environmental conditions; E.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andph-start1(30 d after sown); F.Phenotypic comparison of Col-0 wild type andOE(40 d after sown).

图8PH-START1功能获得和缺失转基因拟南芥表型分析
Fig.8 Phenotypic analysis ofPH-START1transgenicArabidopsiswith functional acquisition and loss

A-B.OE拟南芥叶片的表型； C-D. ph-start1拟南芥叶片的表型；E.OE叶面积统计；F.ph-start1叶面积统计。A-B.OE Arabidopsis leaves phenotype; C-D.ph-start1 Arabidopsis leaves phenotype; E.Comparison of leaf area of OE Arabidopsis;F.Comparison of leaf area of ph-start1 Arabidopsis.

观察相同培养条件下培养的OE和ph-start1的全部莲座叶，选择同一部位的莲座叶进行叶面积和叶柄长度的测定(图9)。结果发现，与野生型相比，OE的叶片极显著变小，叶面积为0.11，0.12 cm2，只占对照的4.89%，5.33%；ph-start1的叶片极显著变大，叶面积为2.94，3.05 cm2，占对照的142%，148%。表明PH-START1的过量表达严重影响了拟南芥叶片的发育，PH-START1表达量的下降可以促进叶片的发育。

3 讨论

拟南芥中PH-START1含有PH-START结构域，PH结构域首次被鉴定时认为是蛋白质结合域，现多参与细胞内信号传导、细胞骨架组织、膜转运和磷脂修饰[17-18]。START结构域首次被发现是在急性调节蛋白中，它是一个与脂类和甾醇类物质结合相关的结构域，负责将急性调节蛋白中的胆固醇转移到线粒体内膜[19-20]。在拟南芥中含START结构域的蛋白质家族共有35个成员，其中21个被融合在同源异型结构域中，此现象表明START结构域在植物的生长发育过程中起到了重要的作用[21-22]。随着拟南芥的生长发育，PH-START1在各个组织中均有不同程度的表达，根中主要在幼苗期表达量较高，莲座叶中主要在生长的第6片莲座叶表达量较高，花中主要在15花期表达量较高，角果中主要在授粉后5 d表达量较高，在花器官发育过程中，相对萼片、花瓣和雌蕊而言，雄蕊中PH-START1的表达量最高。

植物的生长周期分为2个阶段即营养生长阶段和生殖生长阶段。营养生长是生殖生长的基础，根系的发达才能从周围土壤中吸收大量的水分和营养物质，通过轴向和径向运输传递给茎和叶，使其茁壮生长，可以有效地抵制各种生物和非生物胁迫，并且为生殖生长做好准备。与野生型相比，过表达PH-START1拟南芥主根短、主茎细弱、莲座叶小，ph-start1的主根较长、主茎较粗、莲座叶大。PH-START1表达量的升高严重抑制了拟南芥的发育，说明PH-START1在拟南芥生长发育中起着负调控作用。至于PH-START1负调控拟南芥生长发育的分子机制，还需要对其进行转录组、蛋白质组及互作蛋白进行分析，建立植物生长发育调控网络，阐明植物生长发育调控机制。