台州地区儿童肺炎支原体感染及23S rRNA突变情况的多中心调查

应小明 王丽珍 郑昌华 杨善浦

[摘要] 目的 了解臺州地区儿童急性呼吸道感染中肺炎支原体（MP）的感染情况及其对大环内酯类药物耐药情况。 方法 在台州市第一人民医院、台州医院、温岭市第一人民医院和玉环人民医院4家医院儿科2016年1月～2017年12月进行多中心调查，共收集4395例0～14岁急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本，采用Real-time PCR法检测MP阳性率及耐药基因（23S rRNA）的突变情况，并对临床资料进行统计分析。 结果 Real-time PCR结果显示，在4395例急性呼吸道感染患儿中，MP感染742例，感染率为16.88%，其中有422例23S rRNA突变，突变率为56.87%。不同季节MP感染率比较，差异有统计学意义（P < 0.05），夏季最高为23.56%;不同年龄组间MP感染率比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且随着年龄的增长而升高;不同性别患儿MP阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;不同季节、不同性别患儿23S rRNA突变率比较差异无统计学意义（P > 0.05）;不同年龄患儿23S rRNA突变率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 多中心联合研究结果显示，MP感染可能与气候、年龄相关，MP感染夏季多发，大龄儿童多见，同时，MP对大环内酯类药物的耐药率较高。

[关键词] 肺炎;肺炎支原体;耐药;患儿;多中心

[中图分类号] R725.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（b）-0038-04

[Abstract] Objective To know about the infection conditions of Mycoplasma pneumonia （MP） and conditions of drug resistance to macrolides of children with acute respiratory infection in Taizhou region. Methods Through multicenter investigation of pediatric departments in the 4 hospitals of Taizhou First People′s Hospital， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， the First People′s Hospital of Wenling and the People′s Hospital of Yuhuan， the respiratory tract samples of 4395 cases of children with acute respiratory infection were collected from January 2016 to December 2017. Real-time PCR was used to detect the positive rates of MP and the mutations of its drug resistance gene （23S rRNA）. Then the clinical data was analyzed. Results The results of Real-time PCR showed that among 4395 children with acute respiratory infection， 742 cases were MP positive， the infection rate was 16.88%， among whom， there were 422 cases of mutation of 23S rRNA， the mutation rate was 56.87%. There was statistically significant difference of the positive rates of MP among different seasons （P < 0.05）， among which， summer （23.56%） was the highest. There was statistically significant difference in the positive rates of MP among different age groups （P < 0.05）， and it increased with age. There was no significant difference in infection rate of MP between children of different sexes （P > 0.05）; there was no significant difference in mutation rate of 23S rRNA among children of different seasons and sexes （P > 0.05）; and there was statistically significant difference in mutation rate of 23S rRNA among children of different ages （P < 0.05）. Conclusion This multicenter combining research shows that MP infection may have correlation with climate and age. MP infection is more common in summer and older children. At the same time， MP has higher drug resistance rates for macrolides.

[Key words] Pneumonia; Mycoplasma pneumonia; Drug resistance; Children; Multicenter

近年发现由肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）引起的儿童难治性肺炎呈逐渐增多的趋势，其原因部分归于MP耐药[1-2]。同时，在临床上耐药MP感染与混合感染二者引起的肺炎比较难区分，给实际诊治工作带来了困难[3]。由MP所引起的肺炎及其肺外并发症（如脑膜炎、心肌炎和肾炎等）对小儿健康造成了严重伤害[4]。鉴于兒童处于特殊的生长发育时期，儿童感染MP首选大环内酯类药物来进行治疗[5]。然而，近年来MP对大环内酯类的耐药性越来越强，主要是药物靶位改变导致的，尤其是23S rRNA基因突变[6]。不同地区MP对大环内酯类的耐药率差异较大，我国该种耐药情况比较严重，近年来部分地区MP对大环内酯类的耐药率甚至还在不断上升[7]。为了解当前台州地区儿童MP的感染情况及其对大环内酯类抗菌药物的耐药情况，本研究对台州地区的4家医院进行了一项多中心研究，现报道如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象

依据《诸福棠实用儿科学》第7版临床诊断标准[8]，选取2016年1月～2017年12月台州市第一人民医院、台州医院、温岭第一人民医院、玉环人民医院4所医院临床诊断为急性呼吸道感染的门诊及住院患儿作为研究对象。纳入标准：①符合诊断标准;②年龄0～14岁;③有完整的临床资料。排除标准：①免疫功能异常者;②既往重症肺炎未痊愈者;③合并结缔组织疾病者。本研究经4所医院医学伦理委员会批准备案。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器  H2100R台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）;T100 PCR扩增仪[Bio-Rad Laboratories（Shanghai）Co.，Ltd];HB-100型电热恒温水槽（徐州淮博仪器设备有限公司）;迈瑞MR-96A酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）;Milli-Q纯水系统[默克化工技术（上海）有限公司]。耐药突变位点检测试剂盒（江苏默乐生物科技股份有限公司，国械注准：20143402242，生产批号：2016071321、201708 2172）;MP快速液体培养基（北京联立信生物技术有限公司）。

1.2.2 标本采集  在入院24 h内采集所有患儿2 mL外周血（用于MP抗体检测），同时采用无菌咽拭子采集患儿咽部分泌物（用于培养基培养及耐药性检测）。

1.2.3 检测方法  ①DNA提取，在咽拭子样本管中加入2 mL生理盐水，置于振荡器上使其充分混匀;取相应数量的2.5 mL离心管，将混匀的样品逐个加入其中，待高速离心（转速15 000 r/min，离心半径为12 cm）10 min后吸去上清液，同时保留底部细胞沉淀，将50 μL裂解液和5 μL内标液加入EP管中;EP管置于漩涡混合器上充分混匀，高温金属浴10 min（100℃）;待冷却至室温后又高速离心10 min，所得上清液即为DNA模板。②DNA扩增，上游引物序列：5′-AGGCTGAGTACTGCCCAAGAG-3′，下游引物序列：5′-CAACTGGAGCATAAGAGGTGT-3′。在生物安全柜中将提取的5 μL DNA模板、5 μL阴性对照和5 μL质控品分别加入相应编号的反应液中，短暂离心后通过传递窗传递至扩增区。PCR参数：98℃，2 min;95℃，10 s;72℃，1 min，40个循环，64℃延伸10 min。荧光信号的收集定为FAM（2063或2064A∶G突变）、VIC（肺炎支原体）和CY5（内标），64℃延伸结束后，采集上一个循环的荧光信号。③结果判定：反应结束后，仪器自动保存结果（以Ct值显示）。Ct值20.00～25.00为强阳性对照的目的基因;Ct值29.00～34.00为弱阳性对照的目的基因;Ct值≤35.00为内标。采用FAM荧光指示23S rRNA耐药突变，采用VIC荧光指示肺炎支原体，结果判读标准见表1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计处理，感染率、突变率等定性数据以百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MP感染及23S rRNA突变情况

共入选4395例患儿，其中男2545例，女1850例。有742例MP感染，感染率为16.88%（742/4395），其中23S rRNA突变422例，突变率为56.87%（422/742）。

2.2 不同季节患儿MP感染及23S rRNA突变情况比较

根据季节将患儿分为4组，分别为春季组（3～5月）、夏季组（6～8月）、秋季组（9～11月）、冬季组（12～2月），其中夏季组的感染率最高为23.56%，MP感染率与季节有显著的相关性（P < 0.05），23S rRNA突变与季节间不存在相关性（P > 0.05）。见表2。

2.3 不同年龄患儿MP感染及23S rRNA突变情况比较

根据患儿的年龄将其分为4组，分别为<1岁组、1～3岁组、>3～6岁组、>6～14岁组。不同年龄组间患儿的MP感染率在5.21%～33.19%之间，与年龄存在一定相关性（P < 0.05），随着年龄的增长，患儿MP阳性率呈上升趋势;不同年龄组间患儿23S rRNA突变率在50.75%～66.95%之间，也与年龄存在一定的相关性（P < 0.05）。见表3。

2.4 不同性别患儿MP感染及23S rRNA突变情况比较

根据患儿性别将其分为男性组及女性组，MP阳性率分别为16.03%和18.05%，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）;突变率分别为58.82%和54.49%，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3 讨论

近年来，肺炎支原体肺炎的发病率有所上升，并且进行治疗的大环内酯类药物耐药也有所增加[9]。以往认为MP对大环内酯类药物敏感性高，2001年日本首次报道大环内酯类抗生素耐药MP株后，引起了普遍关注，并逐渐成为研究热点[10]。有研究表明，感染耐药MP患儿的临床过程明显长于感染敏感MP的患儿，且抗生素的用药疗程或更换频率要远远高于感染敏感MP的患儿，推测其临床疗效欠佳可能与MP耐药株增多有关[11]。

本研究多中心收集的4395例急性呼吸道感染儿童咽拭子检测MP阳性率为16.88%，高于宝鸡地区的12.1%[12]。患儿性别则与感染率无相关性。MP感染主要通过呼吸道，在我国各个季节均可发病，但不同地区有所差异（北方以冬季為主，而南方以夏秋季为主）[13]，本研究结果显示夏季感染率最高为23.56%，对台州地区夏季预防MP肺炎有一定的指导意义。广州、苏州、北京等地区的研究结果均报道MP感染率随着年龄的增长而增加[14-16]，与本研究结果一致，本研究结果显示，>6～14岁组MP感染率最高（33.19%）。这可能与>6～14岁组儿童日常所处的环境轨迹有关，这一年龄段的儿童已经上学，大部分时间为集体生活学习，所处环境人口密度相对较高，这可能增加了交叉感染的机会。

MP耐药菌株的出现对临床治疗是一项严峻的挑战。既往研究显示，我国MP分离菌株对大环内酯类药物的耐药率高于70%[17-19]。本研究结果显示，在MP感染阳性标本中，23S rRNA基因位点突变率较高（56.87%），表明台州市儿童感染的MP对大环内酯类药物耐药，应当引起特别重视。Real-time PCR法具有敏感性高、特异性强的特点，可快速提供MP感染的诊断，且可以检测耐药基因突变情况，也可指导如何有效使用抗菌药，有利于对MP进行早期诊断，提示临床优化治疗方案[20]。

大环内酯类药物具有口服后吸收好、组织中浓度高、毒副作用较低、适用于儿童等特点[21-23]，在未来临床上仍将是儿童常用治疗支原体肺炎的主要抗生素。因此在临床中需进一步加强儿童大环内酯类药物耐药性的监测，加大监管力度，保证大环内酯类药物的规范合理使用，有效遏制其耐药性的扩大。临床如遇MP发生耐药的情况，可以考虑联合使用广谱抗生素以达到抗感染的目的，此外中药也是有效控制MP感染或耐药MP感染的方法之一[24]。

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（收稿日期：2018-10-05  本文编辑：罗乔荔）