黄酮类化合物抗疲劳作用研究进展

刘威良 黄艾祥

摘 要 黄酮类化合物是一类多酚类物质，广泛存在于植物中，具有抗疲劳、抗氧化、免疫调节等药理和生理活性。文章阐述了疲劳产生的机制，介绍了黄酮类化合物提取、分离、结构鉴定及其抗疲劳作用机理，并针对黄酮类化合物研发抗疲劳功能性食品及其保健品进行了展望。以期为黄酮类化合物的进一步研究做出探索。

关键词 抗疲劳 ；作用机理 ；保健展望

中图分类号 R966 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.015

Abstract Flavonoids compound was one of Phenolic substances， which exist extensively in the plant kingdom. It has some important pharmacological and physiological activity such as anti-fatigue， anti-oxidant，Immunomodulatory and so on. The paper ascertain mechanism of fatigue， introduced the structure and the technology of flavonoidss extraction and separation andthe mechanism of its anti-fatigue effect， then prospect its development and utilization in the area of anti-fatigue functional food and health products.

Keywords anti-fatigue ； action mechanism ； health care prospect

疲劳是指体力或脑力劳动到达一定阶段时必然会出现的一种正常生理现象，这是从中枢神经系统至骨骼肌细胞再到细胞内物质的代谢过程，是机体复杂的生理变化过程，中间任何一过程或环节变化均可导致疲劳的产生[1-2]。疲劳是普遍存在的一种生理现象，人们对疲劳的认识在不断地加深，莫桑首次提出“疲劳”的概念[3]，而后人们根据属性不同，将疲劳分为生理性和病理性疲劳。若能通过适当的休息得到缓解或者消除疲劳者，属生理性疲劳；而不能通过休息或者药物解除，并且有器质性损害者，属病理性疲劳。国外学者WATANABE等[4]将疲劳分为4种，即运动性、中枢性、免疫性及热环境性疲劳。而黄林章[5]把疲劳归结为外周和中枢疲劳两大类，前者主要是指肌肉的疲劳，表现为肌肉酸疼、肌肉力量下降、动作迟缓、协调能力下降不灵敏等；后者是指运动过度后脑组织中5-羟色胺、γ-氨基丁酸等神经递质含量发生变化，打破了中枢神经系统的兴奋与抑制之间的稳态，引发的中枢性疲劳。

现代人的工作学习压力大，生活节奏快，身体常处于亚健康状态，因此易于出现疲劳，造成工作学习效率低，这迫切需要得到缓解，尤其是在运动界、高原和一些井下工作的特殊人员更需要克服疲劳。具有抗疲劳的化学药物多为大脑皮层兴奋药物，在大脑皮层处于抑制状态时这类药物作用就更为显著，此类药物主要抗疲劳作用方式为兴奋大脑、消除睡意，可使服用者保持较长时间的连续工作状态，其代表药物有咖啡因、苯丙胺、利他林、甲氯芬酯、吡拉西坦、莫达非尼，但这些抗疲劳化学药物多具有成瘾性，副作用大，这就制约了其在临床上应用[6]。近年研究重心转向从一些药食同源植物中寻找抗疲劳因子。大量研究表明一些植物源活性成分如多糖[7-8]、皂苷[9-12]、黄酮[13-14]、生物碱[15-18]、多酚[19-21]等均具有抗疲劳功效，为抗疲劳功能性食品的研发提供了物质基础。经由運动医学和食品营养学交叉互补，大量实验数据表明天然产物可影响机体的能量代谢，从而产生抗疲劳效果。本文就近年来黄酮类化合物抗疲劳作用及其他药理活性研究进展进行综述。

1 疲劳产生机制

运动性疲劳产生的机制比较复杂，目前尚存诸多争论，近些年一致认同的有自由基-脂质过氧化、能源物质耗竭、致劳物质蓄积、大脑皮层的神经保护性抑制学假说。

1.1 氧自由基-脂质过氧化学说

正常人在新陈代谢过程中，会产生大量反应氧族（Reative Oxygen Species，ROS）），如一些羟基自由基、单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢等，它们可以与磷脂分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质，损伤肌细胞膜。过量的ROS积累会导致体内氧化还原系统失衡，从而引发细胞内蛋白质和核酸的氧化应激损伤，最终引起细胞凋亡和肌肉等组织器官功能损伤，进而导致疲劳的产生[22-24]。自Dillare首次将自由基引入运动医学范畴，国内外学者针对自由基与运动之间的相互影响进行了诸多探索。1982年Davies等[25]首次应用电子自旋共振技术（ERS））直接证实了力竭运动后肌肉、肝脏中的ROS显著增加，亦反映运动是自由基过度堆积的诱因之一。随后，众多动物和临床实验研究也表明，急性剧烈运动时，机体清除过量自由基的能力不足，体内细胞处于氧化应激状态，从而导致细胞损伤，进而诱发疲劳行为。有研究表明运动产生细胞氧化应激损伤的作用机制一般有黄嘌呤氧化酶机制和线粒体机制，最近又有学者提出了前列腺机制、中性粒细胞机制和钙机制[26]。

1.2 能源物质耗竭说

该学说认为，当机体运动时对能源的需求增加，同时未得到及时供给，又因有氧代谢能力不足，需通过无氧呼吸补充能量。运动的同时导致体内氧化与抗氧化系统失衡，阻碍了磷酸腺苷活化蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）的活性，以致使ATP的过度损耗和氧代谢产物（d-ROM））的堆积，引发连锁的生化反应，机体为了避免应激损伤而产生疲劳效应[27-28]。由分子层面上可知，p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK））信号通路的激活，诱发过氧化物酶体增殖物激活受体亚基基因表达的上调，进而增加线粒体的生成；在组织水平上，骨骼肌血管内皮生长因子-A增加的同时，凝血栓蛋白-1减少，骨骼肌毛细血管增生使肌肉功能缺失和运动机能减弱，最终引发疲劳[29-31]。

1.3 致劳物质蓄积学说

众多数据显示[32]，机体在运动过程中肌肉快速收缩，营养物质会分解产生乳酸、丙酮酸和氨，机体清除系统无法及时将其分解成更小的分子，导致机体内环境改变，如体内酸碱、渗透压、离子分布等平衡失调，影响机体的正常代谢，失去原有运动力，从而导致疲劳产生。在高强度运动时机体为了提高能量供应，会消耗大量糖类物质，与此同时氧气的供应不足导致糖酵解作用大量进行，从而生成过量乳酸，致使肌肉中pH值下降，即肌肉中的氢离子浓度升高，加速了疲劳感的产生[33]。

1.4 大脑皮层的神经保护性抑制学说

高强度运动时，能源物质过度消耗，机体内环境紊乱，大脑皮层作为控制运动中枢的靶器官，会产生一系列保护性反应，从而减少机体进一步受到损伤，即剧烈运动时，大量神经冲动传到大脑皮层中相应的神经元，该神经元会长时间处于兴奋状态，为避免其过度损耗，机体会产生抑制冲动，导致运动能力下降，产生疲劳反应[34]。目前对中枢抑制导致疲劳的研究较少，但是也有一些生物学机制已经阐述了中枢性疲劳。研究数据表明脑内5-羟色胺和γ-氨基丁酸含量的上调与下调会加速或延迟疲劳的发生。其他一些神经调控因子，如氨分子和炎性细胞因子，此类成分可以减弱运动的耐受，另外，血液里和脑组织中氨含量的上升也会造成大脑皮层的抑制，最终引发疲劳。总之疲劳受外界因素和大脑皮层抑制调节的综合作用，以此应对运动过度引发的应激反应[35]。

2 黄酮类化合物的提取、分离及其结构鉴定

2.1 提取

首先，黄酮类化合物系色原烷或色原酮的衍生物，主要指以2-苯基色原酮为母核的物质，是一类重要的植化成分[36]。如今泛指2个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物（C3-C6-C3）），又由于这类化合物大多呈淡黄色或黄色，因此称为黄酮[37]。黄酮类化合物资源丰富且易于提取，广泛存在于植物各个器官中，是植物的次级代谢产物之一，多以苷类或游离态形式贮藏于植物细胞质中[38-39]。目前，植物总黄酮的萃取一般采用溶剂提取法，常用甲醇、乙醇、水及其他极性溶剂进行萃取。此外亦用如下几类方法：

2.1.1 超滤法

黄酮类化合物的分子量多在1 kDa以下，而多糖、蛋白等其他物质分子量多在50 kDa以上，采用超滤法可以截留并清除此类杂质，提高黄酮类药液有效成分含量和澄清度，而且在分析过程中准确性高，重复性好。张效林等[40]用超滤法提取侧柏叶总黄酮时，有效的将脂溶性叶绿素和鞣质分开。王羡一等[41]采用均质法和超滤膜法从侧柏叶中获得高纯度的黄酮成分。易克传等[42]采用超滤技术对菊花中总黄酮进行分离，并对提取工艺优化，此法操作简便、分离效果好，总黄酮得率为19.81%。王世岭[43]采用膜分离技术，对中药材黄芩中黄酮类单体黄芩苷进行分离提取，效果颇佳。

2.1.2 超临界流體萃取法

该方法是通过控制临界温度和压力，利用某种液体在临界点附近某区域内具有流动性好、溶解能力强及传递性能高等特点，达到选择性提取和分离目的[44]。目前常用的超临界流体是CO2，与传统方法相比，此技术工艺简单、提取效率高、无溶剂残留、且低温可以保护热敏性成分[45-47]。有研究表明，超临界流体萃取中，不单可用CO2作为媒介萃取一些低极性游离黄酮、黄酮苷类，还可加入乙醇作夹带剂萃取一些极性偏高的黄酮类成分[48]。刘雯等[49]采用超临界流体CO2萃取技术并探讨夹带剂对银杏叶黄酮醇苷提取的影响，结果发现夹带剂可显著提高萃取率。Kotnik等[50]利用超临界CO2萃取从甘菊花中提取 α-红没药醇、母菊素等，这与传统法相比体现出更多优点。但也有一些不足之处，如溶剂选择范围窄、投资成本和设备要求高。

2.1.3 超声辅助提取法

超声波提取法是利用超声波产生的机械效应、扩散、热传递以及空化作用加强细胞内物质的释放，从而加速植物中有效成分的扩散和浸出。超声波频率通常在20～40 kHz[51]。随着科学技术的快速发展，超声提取技术已经广泛用于中草药等植物活性成分的提取中，其具有提取时间短、有效成分溶出高、成本低、低温保护热敏感成分及污染小等优点[52]。张晓旭等[53]采用70%乙醇，60℃超声提取3 h后，通过响应面优化杜仲叶总黄酮的沉淀萃取工艺。Ghasemzadeh等[54]采用超声辅助提取咖喱叶中黄酮类化合物并运用响应面法对其提取工艺进行优化，且对黄酮类化合物的药理活性进行了研究。 Wu等[55]也通过超声辅助提取土荆芥黄酮类化合物，并应用响应面技术对其工艺进行优化。

2.1.4 超高压提取法

此技术起初广泛用于食品保鲜和加工，近年来发展成为一种新型的天然产物提取和加工技术，具有能耗小、提取率高、稳定性好、安全、绿色环保等优点，尤其适合一些中药活性成分，如黄酮、多糖、皂苷、生物碱等的提取分离[56]。孙协军等[57]以超高压技术进行山楂黄酮的提取，对比常规方法，如超声提取法、索氏抽提法有明显优势，作者还利用扫描电镜对此技术为何相比其他传统技术具有黄酮得率高、耗时短、热效应低等优点做出了合理的阐释。敬思群等[58]采用超高压萃取金鸡菊总黄酮，并对其提取工艺进行优化，结果表明，此技术萃取的黄酮得率高且费时少，同时采用红外和紫外光谱分析法证明了超高压对金鸡菊黄酮的结构没有影响。袁亚光[59]亦采用超高压研究了枇杷叶、牡丹花黄酮的提取，结果表明此技术不仅不损坏相应黄酮的构型，还能够提升得率和抗氧化活力。综上所述，超高压技术特别适用于黄酮类物质的萃取，备受广大科研工作者青睐。

2.2 分离与纯化

2.2.1 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（HSCCC））是一种连续高效的液-液分配色谱技术，它是利用两相溶剂体系，在高速旋转的螺旋管内建立起来的一种特殊的单相流体动力学平衡，并实现高效分配、传递依次洗脱达到分离的目的[60]。黄酮类化合物具有多种功能活性，研究其分离纯化技术意义重大，这为生物学实验、药理学实验和临床药效学研究供给充足的样品[61]。Xiao等[62]通过两步分离纯化从黄芪中得到5种黄酮苷类化合物，纯度达到90%以上。彭金勇等[63]用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为两相溶剂从白花败酱草中分离纯化了3种黄酮类化合物，其纯度高达99.2%。李成平等[64]通过建立HSCCC方法从橘皮中快速、高效的分离及纯化出4种多甲氧基黄酮类物质，并对其结构进行了分析。这些实验都显示出此技术高效强大的分离纯化效力。

2.2.2 柱色谱法

该法又名柱层析，即选择相应的固定相填装于柱子中，以一定比列的液体作为流动相，样品随流动相沿柱子方向分离开来。分离纯化黄酮类化合物常用的柱色谱吸附剂或载体有硅胶柱、纤维素粉、葡聚糖凝胶、活性炭、氧化铝和硅藻土等[65]。杨武英等[66]分别应用NKA-9大孔吸附树脂，聚酰胺树脂对梁木果皮黄酮、青钱柳黄酮进行研究，并优化了精制工艺，结果表明此法纯化出的黄酮安全、纯度颇高，普遍适用植物活性成分的分离纯化。Johnston等[67]采用葡聚糖凝胶柱成功的将槲皮素、山奈酚、芹菜素、芦丁、槲皮苷分离开来。有研究报道指出，大孔树脂法在荷叶、芹菜、柚皮、艾蒿等植物黄酮的分离纯化上得到广泛运用。

2.2.3 双水相萃取

此项技术是20世纪中叶提出的，90年代用于天然产物的分离纯化。该法属于液-液萃取，根据待分离成分在两相间的选择性分配，使其分离。因其有价格低、萃取率高、易于操作、污染小等优势，普遍用于黄酮类化合物的富集[68-70]。赵晓莉等[71]利用双水相体系法，分离得到了柿叶黄酮。石慧等[72]采用双水相萃取法，研究加杨叶黄酮的分离并对两相分配比例进行优化，结果表明此法极大提高了加杨叶黄酮的分离效果。

2.3 结构鉴定

2.3.1 平面色谱法

平面色谱法包括纸色谱法和薄层色谱法。 Pozsonyi等[73]用薄层色谱法比较了自然生长条件下和人工栽培的变种中洋地黄叶子里的洋地黄苷的含量差异。郭新华等[74]利用胶束纸色谱法对黄酮类物质进行探究，结果成功的分离了其中几类黄酮苷类成分。

2.3.2 高效毛细管电泳（HPCE））法

Pietta等[75]用MECC法在紫外线二极管阵列检测方法下分析测定了蜡菊属植物中的黄酮类化合物，并对其结构化学组成进行了鉴定。Aremendia等[76]用CZE法结合电喷雾质谱分析方法分离了几种不同的黄酮类化合物，并对其结构进行了鉴定。李芳等[77]通过HPCE法探讨了新疆地区不同采集期的桑叶，对其中芦丁成分进行快速、高效的分离并对其含量进行了测定。

2.3.3 高效液相色谱（HPLC））法

黄酮类化合物的分析普遍使用C18柱。Fang 等[78]用该方法研究了红葡萄酒中十余种黄酮类化合物，如毛地黄酮、杨梅酮、桑色素等。彭全材等[79]建立反相HPLC法对不同产地鱼腥草中黄酮类成分的研究，结果实现了对其中金丝桃苷、槲皮素、异鼠李素等黄酮物质分离并检测了含量。目前样品水解后采用HPLC方法测定总黄酮含量是公认的好方法，另外液质联用技术用于黄酮的检测，不乏是一种全新的技术手段[80]。

2.3.4 紫外分光光度法

此法利用样品在溶解后，与化学试剂作用生成颜色反应，在特定波长处有特异性吸收，操作简便、快速，目前应用较广泛。袁金斌等[81]通过建立一种快速的紫外分光光度法，测定了大豆中一种食品保健因子大豆异黄酮的含量。程研等[82]利用此法建立黄芪中总黄酮的含量测定方法，比较不同产地黄芪药材总黄酮的含量。梁欣格等[83]采用紫外分光光度法测定了黄芪总黄酮的含量，并对此法进行了探讨。

3 黄酮类化合物生物活性功能

3.1 抗氧化及清除自由基作用

自由基被认定为引起心血管、癌症、衰老等退变性疾病的罪恶之源，大量研究表明黄酮类化合物具有很强的清除自由基和抗氧化能力。Georgetti等[84]用化学荧光法对不同类黄酮化合物进行了分析检测，确定了它们的抗氧化能力。研究发现，黄酮类化合物在抗氧化反应中既能清除链引发阶段的ROS，也可以直接将其在反应链中捕获而使链反应终止，起到预防和免断链双重效应[85]。

3.2 免疫调节作用

生物类黄酮具有抗炎作用，其抗炎机制可能在于抑制前列腺素（PG））生物合成过程中的脂氧化酶（LOX））活性。Selleri等[86]研究发现，慢性炎症疾病通常伴有氧自由基和NO含量升高现象，金雀异黄素作为酪氨酸激酶的抑制剂，可以起到一定的抑制NO形成的作用。周月蝉等[87]研究表明，连续30天灌胃小鼠适量藤茶，发现藤茶总黄酮可提高小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能。黄酮类化合物对免疫系统的调节呈现多样性的原因在于研究材料大都为总黄酮，其成分复杂，而具体到哪类单体成分起作用的机制不太明朗，有待进一步考察。

3.3 抗疲劳作用

黄酮类化合物是自然界存在的一种天然抗氧剂，亦称“维生素P”，诸多文献表明，其具有很强的抗氧化活性。运动性疲劳是由诸多因素叠加所致，绝大多数人都承认其可能与自由基的过度积累有关，所以除了增加能源物质的补充，有效的补充黄酮类外源抗氧剂也是一种重要手段。槲皮素（quercetin）及其苷类为植物界分布最广的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌防癌、抗菌抗病毒等作用，能参与细胞凋亡、细胞周期复制、解毒和血管生成等生物过程，最近有研究表明槲皮素对实验动物有较好的抗疲作用[88]。芦丁是广泛存在于自然界中的一类黄酮类物质，大量研究已表明，它具有抗氧化、抗炎、抗衰老、降血压等药理作用。吴涛等[89]通过小鼠负重游泳等实验证明芦丁具有很好的抗运动性疲劳作用。

4 黄酮类化合物抗疲劳作用机制

4.1 对氧自由基清除及抗氧化作用的影响

大量数据已表明，体能过度消耗后，会造成细胞内超氧阴离子等代谢废物的堆积，它们与细胞膜發生脂质过氧化作用，使生物膜如线粒体膜、肌肉纤维膜的结构破损，产生细胞毒性导致肌肉机能下降，从而引发疲劳效应[90]。Haibing等[91]通过体外抗氧化实验研究显示，黄秋葵黄酮能够很好地清除自由基（DPPH）），具有很强的抗氧化效果，推测其可通过加速剧烈运动后自由基的代谢，减少细胞氧化应激损伤来达到缓解疲劳的功效。Kuo等[92]学者亦研究指出，黄酮类化合物不仅能通过清除ROS或降低ROS形成，还可通过免疫系统调节作用提高机体耐受能力，减缓肌肉的损伤、能量的过度损耗，达到抗疲劳作用。邓超等[93]研究表明，通过连续灌胃小鼠冬凌草总黄酮30 d，采用小鼠负重游泳实验并检测相关生化指标，结果发现冬凌草总黄酮可通过提高机体抗氧化能力并抑制力竭运动中氧自由基的产生来延缓疲劳的发生。另外，Lin等[94]研究表明，从黄秋葵甲醇提取物中分离出一种黄酮类单体槲皮素-3-o-龙胆二糖（QG）），通过大鼠负重游泳力竭运动实验，发现QG可以有效提高抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD））和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px））的活力，从而降低高强度运动引发氧化应激对机体的损伤。Yu等[95]研究发现，中药锁阳黄酮提取物能增强体内关键的抗氧酶SOD和GSH-Px的活性，降低脂质过氧化终产物丙二醛（MDA））含量，减缓肌肉疲劳。

4.2 對体内代谢产物调节的影响

研究表明，高强度运动后，能量供给不足会激发糖酵解途径，致使乳酸、丙酮酸、氨类物质等代谢废物堆积，同时为满足机体能量供应，蛋白质大量消耗产生一些代谢废物，如血清尿素氮（BUN））等；骨骼肌细胞代谢失衡导致血肌酐（SCR））含量上升，乳酸脱氢酶（LDH））活力下降，这些代谢废物得不到及时清理就会诱发疲劳的产生[96]。Zhan等[97]研究发现，玉米须总黄酮可通过降低血乳酸（BLA））含量，减少血清尿素氮的产生同时提高肝糖原和肌糖原含量发挥抗疲劳功效。Chunguang等[98]研究表明，红薯叶总黄酮具有一定的抗疲劳作用，其作用机制是降低血清尿氮、血乳酸含量，增加肝糖原和肌糖原的储备量。洪雪娥等[99]研究发现，薯蔓黄酮可通过提高力竭运动后小鼠血清LDH活性，加快血清BUN的代谢，增加肌肉和肝脏糖原含量，进而加强抗疲劳效果。

4.3 对机体能量代谢的影响

机体剧烈运动时需要消耗大量能量，若供给不足将启动无氧呼吸进行维持，易造成氧化应激损伤，为避免由于能量代谢的不足引起机体保护性疲劳反应的产生，有学者发现[100]，将饲喂含有槲皮素饲料的小鼠进行负重游泳实验，借助核磁共振代谢组学研究游泳后小鼠血清代谢谱的变化，结果显示槲皮素能提高力竭小鼠的耐力，加快其能量代谢和脂肪分解。Marco等[101]研究显示，茶叶中的酚类物质中的羟基和剧烈运动过程产生的超氧阴离子结合，促进线粒体呼吸链能量的产生，增加肌细胞ATP含量，消除疲劳感。研究还表明[102]，口服儿茶素能加快线粒体电子传递速率，增强运动VO2max，且具有改善机体能量代谢潜力。

4.4 对中枢性疲劳的影响

中枢性疲劳产生归因于过量运动使脑内抑制性与兴奋性神经递质稳态失衡，降低大脑皮层对外周传递神经冲动，进而产生疲劳感。有报道指出[103]，脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA））含量增加是引发中枢性疲劳的因素之一，γ-氨基丁酸转运体2（GAT-2））基因表达上调可加速GABA的代谢，有助于消除运动过度诱发的疲劳。唐量等[104]研究表明，SD大鼠连续灌胃葛根总黄酮7周，并进行高强度跑台耐力训练，采用基因芯片技术探讨葛根总黄酮抗中性疲劳的分子机制，结果显示，葛根总黄酮可介导调控GAT-2基因表达的途径，加强GAT-2转运GABA的效力，从而消除高强度训练诱发的疲劳。

总之，黄酮类化合物在体内发挥抗疲劳作用可能是单一靶点或多靶点相互作用，其作用机制需要更深入研究，为其开发成为抗疲劳保健食品提供实验依据。

5 展望

黄酮类化合物的医疗保健功效日益得到人们认可，其开发利用已成为功能性食品、保健品、医药等领域的重要研究方向。深化黄酮类化合物的抗氧化、抗疲劳活性研究，将有助于进一步开发其在抗运动性疲劳食品保健方面的应用前景，带来更大的社会效益和经济效益。此类成分在人体中不能生物合成，只能从食物中获得，这就使得学者们更加注重从绿色植物中汲取纯度高、活性强的天然黄酮物质。尽管黄酮类化合物的研究是一热点，但其在体内代谢吸收机制、抗疲劳等功能活性机制及其功能活性成分的确定有待进一步完善。

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