外周血循环肿瘤细胞对早期胃癌的诊断和预后评估价值

向森，焉然，张开芳

1驻马店市中心医院肿瘤内科，河南驻马店463000

2黄河科技学院医学院，郑州450006

早期胃癌（early gastric cancer，EGC）是指肿瘤浸润深度在黏膜及黏膜下层者，其预后与胃癌分期密切相关，早期发现可改善患者预后[1]。然而，约5%的EGC患者术后会发生转移或复发[2]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）是逃过免疫监视，自肿瘤原发部位经淋巴管或直接进入血液循环的肿瘤细胞[3]。研究发现，包括EGC在内的多种肿瘤早期即有CTC侵入外周血[4]。由于胃癌高发人群对该病的重视程度不够，加之使用胃镜大规模筛查EGC具有耗时长、难度大、费用高等缺点，中国胃癌的早期发现率远低于日本[5]。2012年，美国Cell Search检测系统经原国家食品药品监督管理局批准在中国上市，使便捷、无创地早期诊断EGC成为可能[6]。本研究旨在探讨CTC对EGC的诊断和预后评估价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2015年6月于驻马店市中心医院经胃镜检查发现胃黏膜病变、疑似EGC的189例患者作为研究对象。纳入标准：①经胃镜检查发现胃黏膜病变，疑似EGC；②系首次诊断。排除标准：①病理诊断为进展期胃癌者，即胃癌浸润深度超过黏膜下层；②具有其他肿瘤病史的患者。经病理诊断，189例患者中，64例为EGC患者，125例为非EGC患者（胃溃疡89例，慢性胃炎36例）。EGC患者中，男44例，女20例；年龄为32～68岁，中位年龄为56岁。本研究经医院医学伦理委员会审批通过，所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 CTC检测方法

Cell Search系统及其配套试剂均购自美国强生公司。空腹采集患者静脉血7.5 ml，置于储存管（Cell Save管）中，为减少上皮细胞的干扰，须在血常规或生化检查血样采集之后采集，采集后立即送检。将储存管中的血样全部倒入预处理管（Cell Tracks Auto Prep锥形管）内，管内含有磁珠标记的上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体，再加入6.5 ml枸橼酸钠缓冲液，轻柔地颠倒混匀，2000 r/min离心10 min后即可上机检测。Cell Search系统可利用磁场富集和固定Ep-CAM+细胞。依次加入藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗CK81和CK9抗体，异藻蓝蛋白（allphycocyanin，APC）标记的抗CD45抗体，最后加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），避光孵育20 min使细胞核着色。染色完毕后，使用Analyzer系统进行荧光扫描，系统自动选取符合肿瘤细胞形态且有红色标记（CK+）的细胞进行人工判读，CK+DAPI+CD45-的细胞即为CTC阳性。

1.3 诊断、治疗及随访

EGC的诊断和治疗参考2013年版《NCCN胃癌临床实践指南》[7]。所有EGC患者均行腹腔镜下胃大部切除术和淋巴结清扫术，再根据患者情况决定是否行辅助化疗。采取电话、门诊等方式进行随访，所有患者均随访3年，随访截止时间为2018年6月。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，数据均为计数资料。四格表资料的比较采用Pearson χ2检验、连续性校正法或Fisher确切概率法；当20%以上单元理论频数值小于5时，3×2列联表的比较采用似然比χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC检测结果与病理诊断结果的对照

189例患者中，24例患者的CTC呈阳性，均为EGC患者。CTC诊断EGC的灵敏度为37.50%（24/64），特异度为100%（125/125），阳性预测值为100%（24/24），阴性预测值75.76%（125/165），准确率为78.84%（149/189）。（表1）

2.2 不同临床特征EGC患者CTC表达情况的比较

表1 CTC检测结果与病理诊断结果的对照

CTC阳性与CTC阴性EGC患者的淋巴结转移情况、脉管癌栓情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；CTC阳性与CTC阴性EGC患者的性别、年龄、肿瘤位置、浸润深度、分化程度和大体病理类型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 不同临床特征EGC患者预后的比较

表2 不同临床特征EGC患者CTC表达情况的比较

随访3年，所有患者均生存，无死亡病例，其中5例患者复发或转移，59例患者未复发或转移。不同性别、年龄、肿瘤位置、浸润深度、分化程度和大体病理类型的EGC患者的复发或转移情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；CTC阳性、有淋巴结转移、有脉管癌栓的EGC患者的复发或转移率均高于CTC阴性、无淋巴结转移、无脉管癌栓的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同临床特征EGC患者预后的比较

3 讨论

1869年，Ashworth[8]首次在肿瘤患者血液中检测到一种与肿瘤细胞相似的细胞，并首次提出了CTC学说。随着近年来CTC检测技术的进步，越来越多的肿瘤早期血行转移证据被发现，而CTC被认为是EGC远处转移的直接原因[9]。Joosse等[10]研究认为，CTC可检出直径1 mm的肿瘤，而一般影像学检查只能检出直径10 mm左右的肿瘤。虽然胃镜对胃癌的检出率较高，但也可由于操作者熟练程度不佳、病灶微小取材不准等原因导致误诊[11]。因此，CTC成为了胃癌早期诊断的一个研究方向。

既往报道多将各期胃癌作为整体研究，对所有分期的胃癌进行CTC检测，检查CK和EpCAM，检测方法包括免疫学方法和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）[12]，其灵敏度为 25%～82%[13-14]。本研究采用Cell Search系统检测EGC患者的CTC表达情况，结果显示，64例EGC患者中，仅24例患者CTC呈阳性，125例非EGC患者的CTC均呈阴性，灵敏度为37.50%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为75.76%，准确率为78.84%。说明Cell Search系统对EGC的诊断效能显著低于胃镜活检，不适合作为诊断EGC的主要手段，与王振丹[15]的研究结果类似。有研究指出，发生血行转移的肿瘤细胞多已发生上皮-间充质转化，其细胞表面不再表达或下调表达黏蛋白抗原，因此Cell Search系统利用EpCAM抗体进行CTC富集是有缺陷的[16]。近年来，CTC检测技术不断发展，多种标志物联合检测有助于提高EGC的诊断效能[17]。Cyttel™-CTC检测技术的诊断效能较高，使用范围较广，其通过阴性富集法去除血液中99.99%以上的白细胞，基本保证了血液CTC无损地富集，肿瘤细胞在表面抗原、核染色体及形态等方面的变化对检测无干扰[18]。

黄宝俊等[19]对629例EGC患者进行长期随访，结果显示，31例（4.9%）患者因肿瘤复发或转移而死亡，其中血行转移占54.8%，最常见于肝脏和脑转移，且多发生在术后3年内。Msaouel和Koutsilieris[20]的研究认为，多数CTC会因机体免疫或环境不适应而凋亡，仅少数具有器官亲嗜性或活力较强的细胞可以存活下来，经血液或淋巴结实现肿瘤转移。本研究中，术后3年发生肝转移4例，复发1例，与上述研究结果一致。淋巴结转移是胃癌最常见的转移途径，本研究分析了不同临床特征EGC患者的CTC表达情况，结果发现，有淋巴结转移和脉管癌栓患者的CTC均为阳性；CTC阳性与CTC阴性EGC患者的性别、年龄、肿瘤位置、浸润深度、分化程度和大体病理类型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。提示EGC患者的CTC可能来源于淋巴结转移的肿瘤细胞。既往研究报道，淋巴结转移和脉管癌栓均是EGC预后不良的独立危险因素[21]，与本研究结果类似。本研究中，复发或转移的5例患者均为CTC阳性，提示CTC可作为EGC患者淋巴结转移的辅助检查手段，并可能作为预后不良的独立预测因素，与Brungs等[22]的研究结果类似。当CTC阳性时，EGC患者预后不良的可能性较大，采取与高危患者相同的化疗方案可能会使患者获益。

综上所述，应用Cell Search系统检测CTC对EGC的诊断效能较低，但可作为淋巴结转移和预后不良的参考指标。