XIST/miRNA-34 a信号轴调控结直肠癌细胞SW480放疗敏感性的机制研究

付玉娟，殷涛，倪猛，王旸，万里新

郑州大学附属南阳市中心医院1核医学科，3消化内科，4放疗科，5肿瘤科，河南南阳473000

2华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科，武汉430000

结直肠癌的发生、发展受多种因素的影响，包括遗传因素和环境因素等。据统计，近年来结直肠癌的发病率呈现显著上升的趋势[1]。目前，结直肠癌的常用治疗手段是手术辅以放化疗。放疗可以有效杀死肿瘤细胞，延长细胞周期，提高手术治疗的效果。但部分患者具有较低的放疗敏感性，远期效果不能达到预期，因此研究放疗抵抗的分子机制是目前结直肠癌临床和基础研究的重点和热点。本文研究结直肠癌中长链非编码RNA X染色体失活特异转录本（long noncoding RNA X-inactive specific transcript，lncRNA XIST）的表达水平，探讨其与放疗敏感性的关系及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

SW480、HT-29、SW620、LOVO细胞均购自中科院典型培养物保藏委员会上海细胞库，正常结肠上皮细胞NCM460购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）、pcDNA、miRNA-34a模拟物和miRNA-34a抑制剂（anti-miRNA-34a）均购自上海吉玛制药技术有限公司，RNA提取试剂盒、微小RNA（microRNA，miRNA）提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，凋亡检测试剂盒购自南京博泰生物技术有限公司，野生型XIST（XIST-WT）和突变型 XIST（XIST-MUT）3'-非翻译区（3'-untranslated regin，3'-UTR）荧光素酶报告载体购自德国Qiagen公司。流式细胞仪、qPCR仪均购自美国ABI公司，细胞培养箱购自美国Thermo Forma公司，倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 标本选取

选择2016—2018年南阳市中心医院收治的30例结直肠癌患者的结直肠癌组织及其癌旁组织，所有患者均经病理检查确诊为结直肠癌且未接受放化疗，手术切除组织标本后，保存于-80℃冰箱。

1.3 细胞培养及转染

将结直肠癌细胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）培养于RPMI-1640培养基中，加入10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，显微镜下观察细胞的生长状态，待其浓度约为80%，加入胰蛋白酶消化、传代。将SW480细胞以2×105/孔接种至6孔板中，将转染siRNA-NC、siRNA-XIST、miRNA-NC、miRNA-34a模拟物、antimiRNA-NC、anti-miRNA-34a、pcDNA-NC、pcDNAXIST的细胞分别作为si-NC组、si-XIST组、miRNANC组、miRNA-34a组、anti-miRNA-NC组、anti-miRNA-34a组、pcDNA组、XIST组；将转染siRNAXIST+anti-miRNA-NC的细胞作为si-XIST+antimiRNA-NC组，将转染siRNA-XIST+anti-miRNA-34a的细胞作为si-XIST+anti-miRNA-34a组。待细胞融合度约为80%时，更换为无血清培养基。

1.4 qPCR检测XIST和miRNA-34 a的相对表达量

采用RNA提取试剂盒和miRNA提取试剂盒提取组织或细胞中总RNA和miRNA，加入逆转录酶，合成cDNA。以cDNA为模板进行qPCR。采用Primer 5.0软件设计引物，XIST上游引物为5'-ACGCTGCATGTGTCCTTAG-3'，下游引物为5'-GAGCCTCTTATAGCTGTTTG-3'；miRNA-34a上游引物为5'-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3'，下游引物为5'-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3'；GAPDH上游引物为5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物为5'-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3'。 以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt法计算XIST和miRNA-34a的相对表达量。实验重复3次。

1.5 细胞照射

取si-NC组、si-XIST组以及si-XIST+anti-miRNA-NC组、si-XIST+anti-miRNA-34a组培养24 h的细胞，采用2、4、6、8 Gy的放射剂量一次性照射48 h，照射完成后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养8 h，进行细胞克隆和细胞凋亡实验。

1.6 细胞克隆实验

取si-NC组、si-XIST组以及si-XIST+anti-miRNA-NC组、si-XIST+anti-miRNA-34a组细胞。当培养板中出现明显的细胞克隆，弃去培养液，采用4%多聚甲醇固定30 min，结晶紫染色30 min，低倍显微镜下观察细胞数＞50个的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数=受照射细胞克隆形成率/未受照射细胞克隆形成率×100%。

1.7 细胞凋亡实验

将si-NC组、si-XIST组以及si-XIST+anti-miRNA-NC组、si-XIST+anti-miRNA-34a组采用4 Gy照射的细胞接种至6孔板中，培养48 h后弃去培养基，制成单细胞悬液，加入10 μl异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的膜联蛋白V（Annexin V）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光染色15 min，流式细胞仪检测凋亡率。

1.8 XIST靶基因的预测和验证

通过生物信息学预测软件TargetScan，按照操作流程预测XIST下游调控的靶基因。经过大量的文献筛选，选定miRNA-34a作为研究对象。为了进一步验证XIST与miRNA-34a的靶向关系，构建野生型 XIST（XIST-WT）和突变型 XIST（XIST-MUT）的3'-UTR荧光素酶报告载体，分别共转染miRNA-34a模拟物和miRNA-34a抑制剂，测定双荧光素酶的活性。

1.9 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对-数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XIST相对表达量的比较

XIST在结直肠癌组织中的相对表达量为（3.508±0.594），高于癌旁组织的（1.068±0.076），差异有统计学意义（t=7.057，P＜0.05）。结直肠癌细胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中XIST的相对表达量均高于正常结肠上皮细胞NCM460，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。其中SW480细胞中XIST的相对表达量最高，因此以SW480细胞作为后续实验的研究对象。

2.2 下调XIST表达对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响

si-XIST组SW480细胞中XIST的相对表达量为（0.293±0.020），低于si-NC组的（0.968±0.049），差异有统计学意义（t=22.09，P＜0.05）。si-NC组SW480细胞的凋亡率为（6.553±0.342）%，明显低于si-XIST组的（23.436±1.401）%，差异有统计学意义（t=20.28，P＜0.01）（图1）。照射剂量为 4、6、8 Gy时，si-XIST组SW480细胞的存活分数均低于si-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表1 各细胞系中XIST相对表达量的比较（±s）

表1 各细胞系中XIST相对表达量的比较（±s）

注：*与NCM460细胞比较，P＜0.05

细胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVOXIST相对表达量1.086±0.084 4.120±0.368*1.966±0.182*2.123±0.241*3.125±0.323*

2.3 双荧光素酶报告基因检测结果

TargetScan数据库显示，XIST与miRNA-34a的3'-UTR的部分碱基可互补配对（图2）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miRNA-34a组XISTWT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性低于miRNA-NC组，anti-miRNA-34a组XIST-WT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性高于anti-miRNANC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；miRNA-34a组和miRNA-NC组XIST-MUT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；anti-miRNA-34a组和anti-miRNA-NC组XISTMUT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

图1 流式细胞仪检测SW480细胞的凋亡情况

表2 不同照射剂量si-NC组和si-XIST组SW480细胞的存活分数（%）

2.4 miRNA-34 a相对表达量的比较

图2 TargetScan数据库预测miRNA-34 a与XIST间的靶向结合位点

表3 不同组别XIST-WT和-XIST-MUT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性（x± s）

miRNA-34a在结直肠癌组织中的相对表达量为（0.482±0.110），低于癌旁组织的（1.146±0.078），差异有统计学意义（t=8.529，P＜0.05）。结直肠癌细胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中miRNA-34a的相对表达量均低于正常结肠上皮细胞NCM460，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

2.5 XIST与miRNA-34 a相对表达量的关系

qPCR检测结果显示，XIST组的miRNA-34a相对表达量为（0.256±0.017），低于pcDNA组的（1.003±0.086），差异有统计学意义（t=14.76，P＜0.05）；si-XIST组的miRNA-34a相对表达量为（3.459±0.352），高于si-NC组的（0.986±0.094），差异有统计学意义（t=11.76，P＜0.05）。

表4 各细胞系中miRNA-34 a相对表达量的比较（±s）

表4 各细胞系中miRNA-34 a相对表达量的比较（±s）

注：*与NCM460细胞比较，P＜0.05

细胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVO miRNA-34a相对表达量0.983±0.099 0.256±0.027*0.593±0.059*0.452±0.046*0.368±0.038*

2.6 anti-miRNA-34 a逆转si-XIST增强SW480细胞辐射敏感性的能力

照射剂量为2、4、6、8 Gy时，si-XIST组SW480细胞的存活分数均低于si-NC组，si-XIST+anti-miRNA-34a组SW480细胞的存活分数均高于si-XIST+anti-miRNA-NC组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表5）。si-XIST 组 SW480细胞的凋亡率为（26.330±2.863）% ，高 于si-NC组 的（7.215±0.765）%，差异有统计学意义（t=11.17，P＜0.05）；si-XIST+anti-miRNA-34a组SW480细胞的凋亡率为（14.244±1.467）%，低于si-XIST+anti-miRNA-NC组的（24.132±2.363）%，差异有统计学意义（t=6.158，P＜0.05）。

3 讨论

随着中国物质生活水平的提高以及生活方式的改变，结直肠癌的发病率显著增加，且患者的病死率较高。有研究者从基因靶向治疗探索结直肠癌放疗抵抗的作用机制，发现在结直肠癌发生发展的过程中伴随lncRNA表达的变化[2-4]。lncRNA是一种不编码蛋白的RNA分子，其表达量具有时间、空间以及组织特异性，在多种疾病中的表达量异常。近年来的研究表明，lncRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用，调控肿瘤细胞的增殖、侵袭等过程[5-8]。XIST是雌性哺乳动物X染色体转录沉默过程中的长链非编码RNA，在X染色体失活过程中发挥重要作用。研究证实，XIST与肿瘤的形成、发展密切相关，降低XIST的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，促进细胞凋亡，从而发挥抑癌基因的作用[9-10]。在胃癌组织中，XIST表达量上调，且与淋巴结转移和TNM分期有关[11-12]。在鼻咽癌中，XIST的表达量显著上调，与细胞的增殖、放疗敏感性密切相关[13]。然而，XIST与结直肠癌细胞放疗敏感性关系的研究较少。本研究应用qPCR技术检测XIST基因在结直肠癌组织、癌旁组织以及结直肠癌细胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中的表达情况，结果显示XIST的表达量在结直肠癌组织和细胞系中均呈现上调，在SW480细胞中表达上调尤其明显，提示XIST与结直肠癌的发生、发展密切相关。本研究利用RNA干扰技术使SW480细胞中的XIST基因沉默，XIST沉默后增强了SW480细胞的放疗敏感性，并诱导了细胞凋亡。

表5 各组SW480细胞的存活分数（%）

miRNA是一类调控基因转录或翻译的非编码单链小RNA，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及肿瘤的形成等过程[14-17]。越来越多的研究表明，miRNA参与多种肿瘤的发生、发展，在肿瘤预防和诊断中的作用日益被关注。研究表明，miRNA与肿瘤细胞的放疗敏感性有关[18-20]。miRNA-34a一种肿瘤抑制因子，其表达量与肿瘤的进展关系密切。研究显示，miRNA-34a可通过作用于下游靶基因，影响肿瘤细胞的增殖和凋亡[21]。在裸鼠人肺癌移植瘤中，miRNA-34a可通过调节下游靶基因RAD51的表达，增加移植瘤的放射敏感性[22]。然而，miRNA-34a的表达是否对结直肠癌的放疗敏感性具有影响以及miRNA-34a在结直肠癌中的作用是否与XIST具有相关性仍不确定。本研究的qPCR检测结果显示，miRNA-34a在结直肠癌组织及细胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中低表达，在SW480细胞中表达下调较明显。生物信息学预测结果显示miRNA-34a可能是XIST的下游靶基因，双荧光素酶报告基因检测结果显示，当共转染miRNA-34a模拟物时，XIST-WT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性明显受到抑制；当共转染miRNA-34a抑制剂时，XIST-WT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性增加。无论是共转染miRNA-34a模拟物还是miRNA-34a抑制剂，XIST-MUT 3'-UTR报告基因的荧光素酶相对活性均无显著变化，进一步验证了miRNA-34a与XIST的靶向调控作用。本研究采用qPCR检测XIST与miRNA-34a的靶向调控作用，结果显示，上调XIST的表达可抑制miRNA-34a的表达量，下调XIST的表达作用正好相反，表明XIST在结直肠癌SW480细胞中可负向调控miRNA-34a的表达量；抑制miRNA-34a的表达可明显逆转下调XIST对SW480细胞放疗敏感性的影响，表明XIST通过靶向调节miRNA-34a，调控结直肠癌SW480细胞的放疗敏感性。

综上所述，XIST在结直肠癌组织和细胞系中表达量增加，下调XIST的表达可增加结直肠癌SW480细胞的放疗敏感性，抑制miRNA-34a的表达可逆转该作用。