长链非编码RNA MAGI 2-AS 3在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义△

李会政，刘琳，崔玲，张颖，刘双，王玲

大连市友谊医院耳鼻咽喉-头颈外科，辽宁 大连116100

喉癌的发病率在头颈部恶性肿瘤中居第2位[1]，尤其在中国北方地区高发。罹患喉癌后，患者呼吸、发声、吞咽等重要生理功能受损，生活质量严重下降[2-3]。喉鳞状细胞癌的发生发展及侵袭转移的基因网络调控机制一直是该病防治研究的关键。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）属于一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，虽然不具有编码蛋白质的潜能，但可在基因网络调控中发挥重要的生物学功能，如参与多种生物学过程和信号通路的调控等[4-7]。近期的研究结果表明，lncRNA与喉鳞状细胞癌发生发展密切相关[8-11]。有学者利用芯片检测发现，MAGI2反义链RNA3（MAGI2-antisense strand 3，MAGI2-AS3）在喉鳞状细胞癌中的表达呈下调趋势[12-13]，提示其可能是喉鳞状细胞癌中异常下调的抑癌基因。然而，MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系以及其细胞生物学功能尚不明确。

本研究检测了喉鳞状细胞癌组织及配对喉正常黏膜组织MAGI2-AS3的表达水平，并进一步分析MAGI2-AS3表达水平与喉鳞状细胞癌临床分期、病理类型、组织学分级及淋巴结转移情况等临床特征的关系，并在体外喉鳞状细胞癌细胞中过表达MAGI2-AS3后观察细胞迁移、侵袭恶性表型的变化以及上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）标志物的改变，明确MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌发生、发展过程中的潜在生物学功能。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2013年1月至2015年12月大连市友谊医院初诊为喉鳞状细胞癌患者80例。患者入院前未行放化疗及生物治疗，经B超、计算机体层摄影（CT）等检查排除其他部位原发肿瘤；无乙肝等感染病病史及家族遗传性疾病病史。肿瘤组织均经过病理检查确诊为喉鳞状细胞癌。80例患者中，男73例，女7例；年龄为39～78岁，中位年龄为60.8岁；有吸烟史77例，无吸烟史3例；临床分型：声门上型36例，声门型38例，声门下型6例；病理类型：高、中分化鳞癌62例，低分化鳞癌18例；临床分期：T1期23例，T2期23例，T3期26例，T4期8例；有颈部淋巴结转移20例，无颈部淋巴结转移60例。选取患者的肿瘤组织及相应癌旁正常黏膜组织用于后续试验。本研究经大连市友谊医院医学伦理委员会批准备案。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol试剂为美国赛默飞世尔公司产品，逆转录试剂盒HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis和SYBR Green法定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒为南京诺唯赞生物科技有限公司产品，实时荧光定量PCR（real-time quantitative-PCR，qRT-PCR）引物由华大基因科技有限公司合成。7500 Fast型qRT-PCR仪为美国应用生物系统（Applied Biosystems）公司产品。

1.3 RNA提取及逆转录

组织总RNA用Trizol试剂提取后，经紫外分光光度计检测浓度及纯度合格后冻存备用。cDNA合成采用逆转录试剂盒进行，反应体系为20 μl：2×RT Mix10 μl，HiScript®Ⅱ Enzyme Mix 2 μl，随机引物1 μl，1 μg总RNA，加无RNA酶去离子水至20 μl。反应条件为25℃下5 min，50℃下45 min，85℃下5 min。

1.4 qRT-PCR检测MAGI 2-AS 3的相对表达量

U6基因为内参，7500 Fast型qRT-PCR仪检测MAGI2-AS3基因CT值，反应体系为20 μl，按照试剂盒说明书进行操作。qRT-PCR反应条件为95℃下30 s，95℃下10 s,60℃下30 s，以上反应设置为40个循环。扩增反应结束后，设置如下反应条件，建立PCR产物溶解曲线：95℃下15 s；60℃下60 s；60℃开始，每个循环增加0.5℃，直至95℃，最后95℃下反应15 s。MAGI2-AS3定量PCR引物，F：5'-GATGTAGCAAGAGTTGGGAAGA-3'，R：5'-CATGTATTATCGCAGTGGGTTTG-3'。内参基因U6定量PCR引物，U6-F：5'-TCGCTTCGGCAGCACATAT-3'，U6-R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'。采用 2-△△Ct法计算MAGI2-AS3相对表达量，其中△△Ct=肿瘤组织（Ct MAGI2-AS3-CtU6）-癌旁正常黏膜组织（Ct MAGI2-AS3-CtU6）。每个样品设3个复孔。

1.5 MAGI 2-AS 3过表达载体的建立

以喉鳞状细胞癌组织cDNA为模板，使用引物MAGI2-AS3-F-NheⅠ ：5'-GCTGGCTAGCATTGCCCTGCGCCCCGAGCGGT-3'和MAGI2-AS3-RXhoⅠ：5'-CGGCCTCGAGGAGAAAATAACAGGATTCATCTCCPCR-3'扩增获得MAGI2-AS3全长序列，亚克隆至pcDNA3.1阳性载体NheⅠ和XhoⅠ位点之间，获得MAGI2-AS3过表达载体，载体经DNA测序验证正确。

1.6 Transwell小室检测细胞迁移、侵袭能力

选取本科实验室存储的喉鳞状细胞癌细胞Hep-2。培养条件为5%CO2、37℃饱和湿度培养，培养基为MEM培养基（美国Gibco公司）加入10%胎牛血清（以色列BI公司）。Hep-2细胞转染过表达MAGI2-AS3载体和空白载体，转染后第2天，计数 1×105个细胞，用 100 μl无血清 DMEM-F12、MEM培养基重悬，加入Transwell小室上室，下室加入约600 μl完全培养基。37℃下5%CO2孵育48 h后取出小室，棉签擦去上室细胞，4%多聚甲醛固定15 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤1次，结晶紫染色10 min后PBS浸洗，拍照后用醋酸洗涤小室，光密度（optical density，OD）450测吸光度。侵袭实验在Transwell小室上室平铺Martrigel胶，其余操作与迁移实验相同。

1.7 蛋白质印迹（Westernblotting）法检测蛋白的相对表达量

空载Hep-2细胞和过表达MAGI2-AS3后的Hep-2细胞用放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（江苏碧云天生物技术有限公司）裂解提取总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术有限公司）说明书检测各样品蛋白浓度，校正上样量；沸水浴加热3～5 min，使蛋白变性，负载缓冲液（loading buffer）混匀后上样于预制胶（上海翊圣生物科技有限公司），100 V电泳2 h，转膜后封闭2 h，4℃一抗过夜摇床孵育，二抗孵育 2 h，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液（美国Advansta公司）浸透后用成像仪检测并获取图像。其中，一抗上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、snail、波形蛋白（vimentin）、内参蛋白GAPDH均购自美国CST公司。

1.8 生物信息学公共数据库

MAGI2-AS3在头颈部鳞癌中相对表达数据来源于TCGA数据库，相应分析图表生成于GEPIA软件。MAGI2-AS3表达中位值是根据GEPIA系统中TCGA测序标准化数据计算得出。MAGI2-AS3表达量在中位值以上定义为高表达，中位值以下定义为低表达。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法，由GEPIA软件自动生成。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAGI 2-AS 3在喉鳞状细胞癌组织及正常组织中的表达情况

在检测的80例喉鳞状细胞癌和相应癌旁正常黏膜组织中，63例喉鳞状细胞癌组织的MAGI2-AS3相对表达量低于癌旁正常黏膜组织，17例喉鳞癌组织的MAGI2-AS3相对表达量高于癌旁正常黏膜组织。比较整体MAGI2-AS3相对表达量发现，癌旁正常黏膜组织的MAGI2-AS3相对表达量是喉鳞状细胞癌组织的（1.504±0.145）倍，差异有统计学意义（t=12.275，P＜0.01）（图1）。

2.2 不同临床特征喉鳞状细胞癌患者的肿瘤组织中MAGI 2--AS3的表达情况

图1 喉鳞状细胞癌组织（n=80）与癌旁正常黏膜组织（n=80）中MAGI 2-AS 3的相对表达倍数

依据2-△△Ct方法计算基因相对表达量后结合患者的临床特征进行分析，结果显示：不同性别、年龄、临床分期、分化程度及吸烟情况患者的MAGI2-AS3相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；但T3+T4期、有淋巴转移患者的MAGI2-AS3相对表达量分别为（0.419±0.253）、（0.303±0.119），均低于T1+T2期、无淋巴结转移患者的（0.823±0.203）、（0.767±0.339），差异均有统计学意义（t=0.975、2.100，P＜0.05）。（表1）

2.3 过表达MAGI 2-AS 3对Hep- 2细胞迁移、侵袭能力的影响

表1 不同临床特征的喉鳞状细胞癌患者肿瘤组织中MAGI 2-AS 3的相对表达量（n=80）

Hep-2细胞过表达MAGI2-AS3后的迁移能力是空载Hep-2细胞的（0.403±0.181）倍，差异有统计学意义（t=4.271，P＜0.01）；Hep-2细胞过表达MAGI2-AS3后的侵袭能力是空载Hep-2细胞的（0.502±0.090）倍，差异有统计学意义（t=77.699，P＜0.01）。（图2）

2.4 过表达MAGI 2-AS 3对Hep- 2细胞蛋白表达的

图2 Transwell小室检测空载Hep- 2细胞（vector）及过表达MAGI 2-AS 3后Hep- 2细胞（OE-MAGI 2-AS 3）的迁移、侵袭能力对比（结晶紫染色，×100）

喉鳞状细胞癌细胞Hep-2过表达MAGI2-AS3后，上皮标志物E-cadherin表达水平高于空载Hep-2细胞，间质标志物N-cadherin、snail、vimentin表达水平低于空载Hep-2细胞。（图3）

2.5 MAGI 2--AS3在头颈部鳞癌组织中的转录水平及与预后的关系

图3 Western blotting法检测过表达MAGI 2-AS 3的Hep- 2细胞的EMT标志物表达情况

利用GEPIA软件上的TCGA数据库分析MAGI2-AS3在头颈部鳞癌组织中的相对表达量，结果显示，在519例头颈部鳞癌组织中MAGI2-AS3的相对转录水平低于44例正常癌旁黏膜组织（P＜0.05）。519例头颈部鳞癌组织中有随访生存信息的患者516例，利用GEPIA软件中的生存模块分析显示，MAGI2-AS3高表达患者的中位生存时间长于低表达患者，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图4）

图4 TCGA数据库中头颈部鳞癌（HNSCC）（n=519）、癌旁正常黏膜（normal）（n=44）中MAGI 2-AS 3相对表达量以及K-M生存曲线（n=516）

3 讨论

lncRNA以往被认为是基因转录产生的垃圾产物或噪音，但研究表明其具有重要的基因网络调控功能，如在转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等过程中都发挥着重要的作用[12]。特别是在肿瘤发生、发展中扮演重要的角色，是目前肿瘤领域的研究热点。MAGI2-AS3由人基因组7号染色体79452957-79471208区域的DNA序列转录产生。Zhang等[13]利用基因芯片检测发现MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织。然而，MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌中的功能和作用机制尚不明确。本研究采用qRTPCR技术对80例喉鳞状细胞癌组织及相应癌旁正常黏膜组织中的MAGI2-AS3表达进行验证，结果显示，喉鳞状细胞癌组织中MAGI2-AS3相对表达量低于癌旁正常黏膜组织，提示MAGI2-AS3表达量降低与喉鳞状细胞癌的发生发展有关。本研究利用GEPIA软件上的TCGA数据库分析MAGI2-AS3在头颈部鳞癌组织中相对表达数据，发现其在519例头颈部鳞癌组织中的相对转录水平低于44例正常癌旁黏膜组织（P＜0.05），这与本研究的检测结果趋势一致。

临床分期、病理类型及是否发生颈部淋巴结转移是喉鳞状细胞癌预后评估的重要临床指标[14-17]。本研究发现声门上型、声门型和声门下型喉鳞状细胞癌患者的MAGI2-AS3相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在组织学分化程度中，低分化喉鳞状细胞癌患者与高、中分化喉鳞状细胞癌患者的MAGI2-AS3相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，不同年龄及是否有吸烟史的患者MAGI2-AS3相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。值得注意的是：T3+T4期、有淋巴转移患者的MAGI2-AS3相对表达量均低于T1+T2期、无淋巴结转移患者（P＜0.05）。肿瘤中表达下调的基因常被认为可能是重要的抑癌基因[18-20]，因此，可以推测MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌中可能通过调控下游蛋白编码基因水平抑制喉鳞状细胞癌恶性表型。本研究在喉鳞状细胞癌细胞Hep-2进一步过表达MAGI2-AS3后发现，Hep-2细胞的迁移能力及侵袭能力均受到抑制（P＜0.01）。同时发现过表达MAGI2-AS3后，可明显改变Hep-2 EMT相关标志物的表达水平。上述结果表明MAGI2-AS3可能通过介导EMT相关标志物的表达发挥对喉鳞状细胞癌侵袭转移的调控，但具体调控机制还需要进一步明确。

TCGA公共数据库中头颈部鳞癌中有随访生存信息的患者516例，利用GEPIA软件中的生存模块分析发现，MAGI2-AS3高表达患者的中位生存时间略长于低表达患者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

综上所述，本研究结果初步证实喉鳞状细胞癌组织和细胞中lncRNA MAGI2-AS3相对表达量降低，且T3+T4期、有淋巴转移患者的MAGI2-AS3相对表达量均低于T1+T2期、无淋巴结转移患者。在未来的研究中进一步明确MAGI2-AS3在喉鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭、转移中的调控机制，对喉鳞状细胞癌发生发展机制的理解及未来的分子靶向治疗具有重要的意义。