抗甲硝唑单链抗体融合蛋白的表达及其ELISA检测方法建立

何扩，张秀媛，王云峰，赵瑞平，李育峰

（河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室，河北北方学院，河北张家口075000）

甲硝唑是一种牲畜饲养中使用时间最长并且最广泛的硝基咪唑类抗生素。甲硝唑不仅可以用作动物的杀菌剂，还可以添加于动物饲料中促进动物生长。因此经常被一些缺乏知识的养殖户及不法分子大量添加到禽类、畜类以及水产养殖中，从而导致甲硝唑污染严重。不仅可以从食物中检测出甲硝唑残留，连有的地下水饮用水也可以检测出甲硝唑污染[1-3]。检测甲硝唑的方法已经成为食品学科的研究热点，其中免疫分析法是目前使用较广泛的方法之一。免疫分析法具有检测速度快、灵敏度高，特异性强等优点，在食品安全快速检测领域受到广泛关注。本试验采用分子克隆技术制备食品污染物的基因工程抗体，这种抗体具有周期短、操作简便、抗体成本低、可工业化生产等优点，具有良好的应用前景[4-6]。

本研究以前期制备甲硝唑杂交瘤为原料，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增抗体的可变区基因，通过带有碱式磷酸酶的质粒PLIP6/GN 构建PLIP6/GN-scFv 表达质粒并实现单链抗体融合蛋白（scFv-AP）可溶性表达，以表达的scFv-AP，建立甲硝唑的酶联免疫检测方法。本研究对利用基因工程抗体实现快速检测动物源食品中甲硝唑残留具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲硝唑鼠源性杂交瘤细胞株：河北省农产品食品安全分析检测重点实验室保存；表达载体PLIP6/GN：法国Frédéric Ducancel 教授惠赠；大肠杆菌JM109：宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌BL21 菌株：河北省农产品食品安全分析检测重点实验室保存菌种；Long Amp Taq DNA 聚合酶、Sfi I 限制性内切酶、Not I限制性内切酶：NEB 公司；T4 DNA 连接酶：Fermentas公司；RNeasy Midi kit 试剂盒、GoScript Reverse Transcription System 试剂盒、氨苄青霉素：Sigma 公司；LB培养液：青岛捷世康生物科技有限公司；PBST 缓冲液、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、异丙基硫代半乳糖苷（均为分析纯）：北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

DYCZ-20C 型DNA 电泳仪：北京六一仪器厂；1708195 型凝胶成像仪、Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白电泳仪、T100 型PCR 仪：美国伯乐公司；DKYⅡ型回转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；SY-601 型电热恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；5804R 型台式冷冻离心机：德国艾本德公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总核糖核酸（ribonucleicacid，RNA）的提取

将甲硝唑杂交瘤细胞培养至106～107，离心机1 000 r/min 转速下离心5 min，弃尽残液，利用RNeasy Midi kit 试剂盒提取总RNA。

1.3.2 抗体可变区基因（VH、VL）扩增与鉴定

利用GoScript Reverse Transcription System 试剂盒将RNA 反转录成第一链互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），以cDNA 为模板，PCR 扩增VH和VL 基因。基因扩增条件为：95 ℃、5 min；95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共35 个循环；72 ℃、10 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收VH和VL 基因片段[7-8]。

1.3.3 重叠延伸PCR 扩增全长scFv 基因

通过两步法将VH、VL 进行重叠延伸连接为一条单链可变区抗体scFv 基因片段。取60 ng 的VH、VL片段互为模板，采用重叠延伸PCR 技术将VH、VL 随机拼接成scFv，第一次PCR 扩增条件为：95 ℃、1 min，65 ℃、1 min，72 ℃、1 min，反应进行20 个循环；第二次PCR 扩增scFv，反应条件为：95 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循环30 次。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收scFv 基因片段[9-10]。

1.3.4 PLIP6/GN-scFv 表达质粒构建

将胶回收scFv 片段和载体质粒PLIP6/GN 分别采用Sfi I、Not I 限制性内切酶双酶切，PCR 产物回收后，采用T4DNA 连接酶将scFv 和PLIP6/GN 连接起来，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆双酶切验证。

1.3.5 融合蛋白scFv-AP 诱导表达

将阳性重组质粒转入表达菌大肠杆菌BL21中，将甲硝唑PLIP6/GN-scFv-BL21 菌株接种于含有100 g/mL 氨苄青霉素的5 mL LB 培养液中37 ℃过夜振荡培养。取50 μL 过夜培养液，按1∶100（体积比）比例转接到新的5 mL LB 培养液（含100 μg/mL 氨苄青霉素）里，培养3 h 左右至菌液浓度的OD600达到0.8～1.0 时，取出500 μL 菌液作为对照，剩余部分加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 进行诱导，继续培养5 h。采用12%聚丙酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，检测目的蛋白。

1.3.6 可溶性scFv-AP 抗原结合活性鉴定

scFv-AP 的抗原结合活性鉴定采用间接竞争酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。纯化的融合蛋白scFv-AP 经PBST 稀释取50 μL，分别与等量的经梯度稀释的甲硝唑标准品溶液

式中：C为抑制率；B为加入不同浓度甲硝唑所测定的A450值；B0为未加甲硝唑的A450值。

1.3.7 样品前处理

各称取2.0 g 虾样品分别放在50 mL 离心管里，加入4 mL 2 mol/L 的氢氧化钠溶液溶解后，加入10 mL乙酸乙酯，震荡搅拌5 min，5 000 r/min 离心5 min。取处理好的上层液5 mL 氮气下吹干后，加入2 mL 正己烷涡动1 min，紧接着用500 μL PBS 涡动30 s。全部倒入2 mL 离心管里，5 000 r/min 离心，取下层液备用。

1.3.8 样品的添加回收试验

分别设置3 个添加浓度即4、10 ng/g 和20 ng/g，分别按照上述处理方法进行直接竞争酶联免疫检测。在该检测方法中，用回收率来表示分析方法测量结果的正确性。回收率计算公式如（2）所示：混合，随后加入到包被好的酶标板，加碱式磷酸酶底物显色。以甲硝唑浓度值为横坐标，以B/B0为纵坐标。抑制率计算公式如（1）所示：

式中：C为回收率；A为甲硝唑的实测质量，ng；B为甲硝唑的添加质量，ng。

1.4 数据处理

使用Excel 软件进行数据统计；序列分析采用DNAMAN、IMGT database 软件处理。

2 结果与分析

2.1 可变区（VH、VL）基因扩增与scFv基因片段拼接

将提取的总RNA 经过反转录获得第一链cDNA，以cDNA 为模板分别扩增VH 及VL 基因片段，扩增的VH 和VL 经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，如图1（条带1、2）所示。

图1 基因的扩增Fig.1 PCR amplification of scFv gene

从图1中可观察在VH、VL 片段的凝胶电泳检测结果中分别有一条明显的带，因此结果显示扩增的VH 基因片段大小为350 bp 左右，扩增的VL 基因片段大小为330 bp 左右，条带较单一，且重链片段长度略大于轻链片段，符合文献报道[11]。

经PCR 扩增获得的VH 和VL 用胶回收试剂盒回收，将轻链、重链片段与linker 进行重叠延伸PCR 扩增，连接得到scFv 片段，结果如图1（条带3）所示，大约在750 bp 时有一条清晰的带，因此scFv 片段大小约为750 bp 且条带清晰，与预期相符。胶回收目的片段，用于后续重组质粒的构建。

2.2 重组质粒阳性克隆筛选、鉴定

将胶回收的scFv 进行Sfi I、Not I 限制性内切酶双酶切，与同样双酶切的PLIP6/GN 载体连接，再转化大肠杆菌JM109，筛选出的阳性克隆进行双酶切验证并测序，阳性克隆双酶切验证结果如图2所示，从图中可以看出有约750 bp 单一条带被切下，证明片段已成功插入质粒，重组成功。

图2 重组质粒酶切验证Fig.2 Enzyme digested products of the plasmid

2.3 scFv序列分析

选取5 个克隆送北京金唯智公司测序，对测序结果进行分析，用比对去掉Sfi I、Not I 及Linker 序列，获得VH 和VL 序列，其中VH360 bp，VL321 bp，与电泳图1结果一致。用DNAMAN 处理VH、VL 序列结果如图3所示，用IMGT database 分析VH 基因序列属于Igh-V7183 VH5 家族，VL 基因属于IGKV4/5 家族，并且序列内不含有终止密码子。

2.4 scFv-AP融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析

将阳性重组质粒转入表达菌大肠杆菌BL21 中，经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导、融合表达产物主要在上清液里，SDSPAGE 结果见图4，重组质粒scFv-AP 出现了明显的表达带，融合蛋白分子量约为75 kDa，与预期相符。目的蛋白分子由两部分构成，一部分是单链抗体分子（scFv），分子量大小约为33 kDa；另一部分为碱式磷酸酶分子，分子量大小约为42 kDa，说明ScFv 被成功表达，可用于后面的ELISA 试验。

图3 scFv核苷酸序列Fig.3 The nucleotide sequence of scFv

图4 融合蛋白scFv-AP的SDS-PAGE检测结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of scFv

2.5 甲硝唑scFv-AP竞争ELISA的测定

为了测定甲硝唑scFv-AP 与抗原之间的竞争性结合，采用间接竞争ELISA 来检测scFv-AP 融合蛋白与氨苄青霉素（ampicillin，AMP）的结合，以AMP 浓度为x 轴，以加入AMP 的吸收度B 与不含AMP 的吸收度B0的比值B/B0为Y 轴绘制标准曲线，标准曲线是典型的S 型曲线。如图5，IC50值为（0.72±0.04）ng/mL，最低检测限IC15值为（0.18±0.07）ng/mL。

2.6 样品添加回收试验

经40 倍PBS 稀释消除基质影响后，在虾肉中添加4、10 ng/g 和20 ng/g，3 个不同含量的甲硝唑标准品，对添加了甲硝唑的虾按照1.3.7 的方法处理后，用于直接竞争酶联免疫分析。根据公式（2）计算样品加标回收率，结果见表1。

图5 甲硝唑间接竞争ELISA标准曲线Fig.5 The standard curve for the ic-ELISA of AMP

表1 直接竞争ELISA法检测虾肉中甲硝唑的回收率（n=3）Table 1 Recoveries of metronidazole in shrimp samples by direct competive ELISA（n=3）

由此可以看出：虾肉中甲硝唑的回收率较好，回收率在88.54%～113.27%范围内。变异系数为7.2%～11.4%。

3 结论

本研究运用基因工程技术，成功构建了甲硝唑表达载体PLIP6/GN-scFv，通过IPTG 将其在大肠杆菌Bl21 中成功诱导表达出融合蛋白scFv-AP，SDSPAGE 电泳检测结果显示，与预期相符。目的蛋白分子由两部分构成，一部分是单链抗体分子（scFv），分子量大小约为33 kDa；另一部分为碱式磷酸酶分子（AP），分子量大小约为42 kDa。ELISA 检测结果显示表达的甲硝唑scFv-AP 与能与甲硝唑发生特异性结合，其IC50=（0.72±0.04）ng/mL，最低检测限为IC15=（0.18±0.07）ng/mL，实际样品检测其回收率在88.54 %～113.27%范围内。本研究成功表达具有高活性的甲硝唑单链抗体融合蛋白，且建立的检测方法可用于实际应用。