剪切应力强度对内皮细胞Piezo1表达的影响

赵一蔚，任培乐，于凤旭，代红燕，聂永梅

1.新疆医科大学基础医学院生理学教研室，新疆乌鲁木齐830011；2.西南医科大学附属医院心脏大血管外科，四川泸州646000；3.新疆医科大学基础医学院机能中心实验室，新疆乌鲁木齐830011

前言

血管内皮细胞处于血管内腔面，是血流与血管壁相互作用的界面，对机械刺激、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化敏感［1］。正常的血管内皮细胞是维持心血管系统稳态的前提条件，其功能异常是心血管疾病早期的重要特征，与动脉粥样硬化、高血压及心衰等疾病的发生、发展关系密切［2］。在机械刺激中剪切应力作为主要的力学刺激，不仅影响内皮细胞形态和功能，还可以调节内皮细胞中基因的表达［3］。当剪切应力≥15 dyne/cm2时，可以促进内皮细胞中血管舒张因子、生长抑制因子和抗氧化剂等的表达，同时可以抑制血管收缩因子、生长因子、炎症介质等的表达，使内皮细胞不易受损。而低剪切应力（±4 dyne/cm2）时，内皮细胞形态呈多角形，排列不规则，易受化学物质的刺激，分泌血管紧张素转换酶等血管活性物质、炎症介质、生长因子、粘附分子，使内皮细胞损伤；促进细胞增生、细胞黏附，诱导内皮细胞功能紊乱，具有促动脉粥样硬化的作用［4-5］。

研究发现Piezo1是一种机械敏感性阳离子通道［6］。该通道表现出参与细胞发育、血管容量调节、细胞迁移，以及细胞增殖和延长等生物学作用，在血管发育形成过程中也有重要参与，目前受到科学家们的关注［7］。已证实在发生动脉粥样硬化过程中，内皮细胞受到显著损害；剪切应力作用下，血管内皮细胞中机械离子通道Piezo1有表达，那么在受到不同强度剪切应力刺激时，Piezo1的生成与表达会有何种变化，尚未有报道。本实验通过加载不同强度剪切应力，从基因和蛋白质水平检测Piezo1表达情况，研究流体剪切应力强度对内皮细胞中Piezo1表达的影响，进而了解流体剪切应力强度是否可以影响Piezo1的表达。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

M199培养基、PBS缓冲液、胰酶、双抗青/链霉素合剂（Hyclone,美国），胎牛血清（Gibco,美国），人纤维黏连蛋白（CORNING,美国），TRIzoL总RNA提取试剂（Thermo Fisher Scientific,美国），PCR 反转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific, 美国），QuantiFast SYBER Greeen PCR Kit（QIAGEN, 美国），Piezo1 引物、β-actin 引物（生工生物,中国上海），RIPA 裂解液（Thermo Fisher Scientific，美国），PMSF（博士德生物, 中国武汉），蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific,美国），BCA 法蛋白定量试剂盒（Pierce,美国），SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Solarbio,中国），4×蛋白上样缓冲液（Solarbio, 中国），预染蛋白分子量Marker（Thermo Fsher Scientific,美国），GAPDH 兔抗多克隆抗体（GOODHERE,中国），兔源抗Piezo1多克隆抗体（Abcam,美国），辣根酶标记山羊抗兔（中杉金桥, 中国北京），SuperSignal West Femto 高灵敏度化学发光底物（Thermo Fisher Scientific,美国）。

1.2 细胞培养

EA.hy926 人脐静脉内皮细胞株（来自上海细胞库）进行常规体外培养，于含10%胎牛血清、1%双抗的M199 完全培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.3 剪切应力加载

将已经过消毒处理的载玻片（75 mm×25 mm），放入10 cm 培养皿中。将1 mL 纤维黏连蛋白（Fibronectin, FN）铺于载玻片上，再将培养皿移至37 ℃恒温培养箱中，静置30 min，回收FN。将消化后的细胞1 mL（1×106个/mL）均匀种植于载玻片上。将培养皿轻轻放至37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，加10 mL M199 生长液到培养皿中，待细胞长满后，将载玻片放置于平行板流槽中，分别加载不同强度剪切应力（根据装置低中高档各设置两组，对应应力依次为0、2.37、4.14、7.11、9.47、14.21、17.76 dyne/cm2）处理2 h。

平行板流室系统是由四川大学设计，提供相关标测数据，成都西木子公司制造。安装后流室的尺寸为：长185 mm，宽95 mm，高0.8 mm。流入孔与流出孔之间的距离为215 mm。实验装置包括恒流泵、流通管、流室、灌流瓶（图1）。用无血清M199培养液作为灌流液体，其粘度为0.72 mPa·s。力学加载过程中储液瓶始终置水浴锅中保持37 ℃，培养液中维持pH 值为7.0，为排除流体静水压的影响，整个装置系统应处在同一个水平面上。

图1 流室系统简图Fig.1 Schematic diagram of flow chamber system

1.4 实时荧光定量PCR

收集细胞，1 000 r/min 离心弃上清，加入1 mL TRizol 试剂混匀。将匀浆样品在室温放置5 min，4 ℃、13 000 r/min 离心10 min，取上清。加入0.2 mL氯仿，4 ℃、13 000 r/min 离心10～15 min，取出水相RNA（约500 μL），加入等体积异丙醇。4 ℃、13 000 r/min离心10 min，去上清，加入30 μL75%乙醇（Rnase-Free ddH2O 配置）洗涤沉淀。用NANODROP 2000 Spectrophotometer核酸定量仪对提出的RNA进行浓度和纯度检测。采用Thermo RevertAid™第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。实时荧光定量PCR，具体操作根据Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）说明书进行。引物序列：Piezo1，F：5'-gcagccgagagaaagagaag-3'，R：5'-agagcagtgggaaccagatg-3'；β- actin，F：5'- ggtagtcaccaaggcattcatt- 3'，R：5'-ctccttaatgtcacgcacgat-3'。配置20 μL体系，按如下条件进行扩增：50 ℃2 min；95 ℃10 min；95 ℃15 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s ；40 个循环后延伸20 s。对扩增产物进行溶解曲线分析。

1.5 Western-blot

自平行板流槽取出玻片，用遇冷的PBS液洗2次，并吸出；加入1 mL PBS刮下细胞，移入1.5 mL无菌的EP管中，高速离心3～5 min，吸出PBS。在EP管中按比例加入蛋白裂解液，冰上孵育30 min，期间漩涡振荡3～4次。之后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，将上清转移到无菌EP管。用BCA试剂盒检测蛋白样品浓度。蛋白变性。SDS-PAGE蛋白质电泳，80 mA恒流，4 ℃过夜转膜，5%脱脂奶粉封闭6 h，加入一抗（1:1 000），4 ℃孵育过夜。取出常温放置30 min，洗涤3 次，每次10 min。加二抗（1:1 000），摇床振荡，室温避光孵育2 h。吸出二抗。蒸馏水洗涤1次，5 min。1:1配置显色液，将显色液敷于PVDF上约3 min，使用Bio-Rad化学发光成像仪中拍照。蛋白分子质量：Piezo1为286 kD；GAPDH为37 kD。

1.6 统计学处理

实验重复3 次，使用SPSS 17.0 统计软件对参数进行单因素方差分析，两两比较采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 剪切应力强度影响EA.hy926中Piezo1的基因表达

加载不同强度剪切应力，处理细胞，qRT-PCR 方法检测Piezo1 mRNA 表达情况，使用2-ΔΔCT进行结果分析。对照组与处理组相比，只有在刺激强度为4.14 dyne/cm2时，Piezo1 mRNA 的表达显著降低（图2），与静止状态比较有显著统计学差异（P＜0.05）。其他处理组与对照组比较均无差异。

图2 不同强度剪切应力对Piezo1 mRNA表达的影响Fig.2 Effects of shear stress of different intensities on the expression of Piezo1 mRNA

2.2 剪切应力强度影响EA.hy926 中Piezo1 的蛋白表达

收集各组细胞，Western-blot 方法进行蛋白测定。通过Image pro plus6.0 对结果进行灰度扫描，定量分析发现蛋白表达与基因表达结果相一致。在刺激强度为4.14 dyne/cm2时，Piezo1 蛋白表达量最低（图3），与对照组比较有统计学差异（P＜0.05）。其余处理组与对照组比较均无差异。

图3 不同强度剪切应力对Piezo1蛋白表达的影响Fig.3 Effects of shear stress of different intensities on the expression of Piezo1 protein

2.3 低剪切应力刺激影响EA.hy926细胞形态

静止状态细胞呈长梭形（图4a）。低剪切应力（4.14 dyne/cm2）刺激后细胞形态不规则，局部可见细胞间隙增大，细胞有脱落现象（图4b）。

3 讨论

3.1 剪切应力影响内皮细胞中Piezo1的表达

图4 光学显微镜下EA.hy926细胞株形态Fig.4 Morphology of EA.hy926 cell lines under optical microscope

血流动力学作为一个重要因素，参与血管的生理和病理调节活动。内皮细胞持续受到血管的力学作用，其中剪切应力（是血流经过血管时内皮细胞受到的与血管壁平行的力）为主要的力学刺激因素之一。内皮细胞在不同区域的血管中，受到的剪切应力也不尽相同。动脉粥样硬化的好发部位，如动脉分叉处和血管弯曲处等为±4 dyne/cm2。正常或稍高的剪切应力（≥10～15 dyne/cm2）可上调内皮细胞的抗炎作用［8］。有研究显示在剪切应力作用下Piezo1 作为力学感受器在小鼠内皮细胞中表达，其表达参与到剪切应力诱导的Ca 的流动以及细胞迁移［9-10］。Piezo1蛋白参与细胞发育、血管容量调节、细胞迁移，以及细胞增殖和延长等作用［11］。那么Piezo1 是否在人内皮细胞中表达？剪切应力是否也会影响内皮细胞中Piezo1的表达？基于此，本研究选取人脐静脉内皮细胞株EA.hy926 作为研究对象［12］，分别设置不同强度力刺激内皮细胞。经检测发现，在静止状态下人脐静脉内皮细胞中有Piezo1表达；通过不同强度力学刺激，观察到强度刺激在4.14 dyne/cm2时Piezo1变化最明显，其基因与蛋白表达均显著降低；相关性分析结果显示，Piezo1表达与剪切应力的强度梯度无相关性，Piezo1对强度为4.14 dyne/cm2最为敏感。原因分析可能需要选择不同的力作用时间来检测其生物特性。

3.2 剪切应力影响内皮细胞中Piezo1 表达的临床意义

2010年Coste等［6］研究发现Piezo1是机械敏感阳离子通道，由Piezo1/FAM38A基因编码，由包含了30个跨膜区域约2 500个氨基酸构成，参与多种生理学过程。类似于许多对机械敏感的内生性阳离子通道，通过GsMTx4可以抑制Piezo1的活性［13］。Miyamoto等［14］发现膀胱上皮中Piezo1缺失时的应力诱导会引起Ca流动减少，以及ATP释放减少。Piezo1在皮肤、膀胱、肾、肝、内皮细胞、牙周组织细胞及红细胞中有广泛表达［15］。Li等［16］研究显示Piezo1在小鼠发育血管的内皮细胞中表达，Piezo1基因的缺失会导致小鼠胚胎发育的致命性损伤，在妊娠中期造成血管重构缺陷。Piezo1是血管发育的重要因素，体外层流剪切应力作用下内皮细胞中Piezo1缺失，表现出细胞排列缺陷，这些提示Piezo1的机械力传导与细胞的形态学调节有关［9］。静止状态下，人脐静脉内皮细胞缺少Piezo1时，表现为eNOS蛋白总量减少，血管内皮生长因子诱发的Ser-1177（增强eNOS活动的关键因子）的磷酸化水平降低，以及内皮细胞迁移受到抑制［11］。Huang等［17］通过研究发现MiR-103a在急性心梗患者中明显升高，而这一过程可能是通过调节Piezo1的表达来实现的。Piezo1的结构和功能影响高血压的发生过程［18］。运动过程中血流可以影响Piezo1这一机械通道，最终引起血管的收缩过程［19］。本课题组前期研究明确动脉粥样硬化好发部位的流体剪切应力在4 dyne/cm2左右［20］。4 dyne/cm2强度比10 dyne/cm2强度明显刺激内皮细胞MCP-1蛋白增高［21］。低剪切应力诱导IL-8表达，且4.2 dyne/cm2时的蛋白量最高［22］。Fractalkine在动脉粥样硬化中也起重要作用，而低剪切应力可以诱导内皮细胞Fractalkine表达上调，这一过程有低剪切应力激活的p38信号分子参与［23］。本实验显示低剪切应力4.14 dyne/cm2可以明显降低Piezo1在内皮细胞中的表达，提示Piezo1可能参与低剪切应力诱导的动脉粥样硬化过程。

本研究通过对内皮细胞进行不同强度的力学刺激，发现低剪切应力4.14 dyne/cm2降低Piezo1在内皮细胞的表达，这为了解复杂的生命发育过程提供了新方式和观点。然而剪切应力是如何刺激Piezo1 表达，Piezo1又是否以及如何参与动脉粥样硬化的发生发展过程，还需要进一步深入研究。