甜叶菊总黄酮提取条件、成分与抗氧化活性研究

童红梅，宋巧，王保平，郭敏，彭涛，张敏

（甘肃医学院，甘肃平凉 744000）

0 引言

甜叶菊（Stevia rebaudiana）别名甜菊、糖草，属菊科（Compositae），斯台维亚属，原产南美亚热带地区。全株都有甜味，其甜度是蔗糖的200～300倍，热值仅为蔗糖1/300，是一种可替代蔗糖的天然甜味剂[1]。此外，甜叶菊茎叶中还含有大量蛋白质、脂肪、纤维素、灰分、无氮浸出物和生物活性成分，因此，它可作为多种产品综合开发利用的资源[2]。许多资料报道，甜叶菊有一定的药理作用，有控制血糖，降低血压，促进新陈代谢的作用，亦有治疗糖尿病，肥胖症、调节胃酸和恢复神经疲劳之功效[3]。

近年来，国内外研究人员在甜叶菊中发现了一些黄酮成分，这些黄酮具有防治心血管疾病、降糖、降脂、镇静消炎、抗菌杀虫、抗氧化延缓衰老、防癌抗肿瘤等作用，并可作为保健功能因子添加到食品、日化以及医药制品中[4-5]。但对甜叶菊的研究主要集中在甜菊糖苷的提取、研究和应用方面，而对其黄酮类物质的提取条件、成分检测与抗氧化活性的方法研究报道不多[6-9]。

本研究为了探究甜叶菊茎叶中总黄酮含量与其抗氧化活性之间的关系，以甘肃酒泉产的甜叶菊为原料，通过对其总黄酮从提取条件、成分、抗氧化活性的相关性等方面进行分析研究，以期为甜叶菊黄酮类保健产品的开发研制提供基础性研究资料。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

甜叶菊选购于酒泉市肃州区农贸市场，品种为惠农1号，特请肃州区农业局农技科人员进行了鉴定。冷藏于0℃的冰箱中备用。

1.1.2 试剂、仪器

（1）试剂：圣草枸杞苷、芦丁、山奈素、槲皮素、橙皮苷和Trolox的标准品均购自Sigma公司（美国）。DPPH、TPTZ购自Wako化学试剂公司（美国），HPLC洗脱的甲醇为色谱纯（加拿大）。其他试剂均为分析纯。

（2）仪器：Agilent高效液相色谱仪-1290LC（美国），色谱柱 ODSC18 柱（4.6 mm×250 mm），中药超声提取机（JBT/C—YCL500T/3P，山东金百特），Heidolp旋转蒸发仪（德国），微孔过滤器（天津双吉实验材料经营部），752E分光光度计（天津）。

1.2 甜叶菊茎叶中黄酮类物质提取条件的优化

1.2.1 样品提取

取冷冻样品3 g，液氮中充分研磨后按照料液比加入80%乙醇。在室温下用中药超声提取机提取（表1），提取液过滤后经Heidolp旋转蒸发仪（德国）减压蒸干，最后用1mL甲醇定容转移至1.5mL的Eppendorf管中离心去掉沉淀，用针头式微孔过滤器 （有机系，孔径0.30μm）过滤，接取少量滤液以备HPLC分析和抗氧化活性检测，重复3次[10]。

表1 甜叶菊黄酮提取方法正交因子Table 1 Orthogonal factors for flavonoids extraction from stevia

1.2.2 正交试验

按L1644进行正交试验。以芦丁提取率为指标，确定甜叶菊中黄酮提取最佳条件，并对正交试验的结果进行重复验证试验。

1.3 甜叶菊茎叶中总黄酮含量旳测定

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品5.0mg，以25 mL甲醇为溶剂，溶解于容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得到浓度为0.2mg/mL芦丁标准溶液。将芦丁标准品溶液和甜叶菊茎叶中总黄酮样液以甲醇为空白对照，在波长358 nm测定吸光度[11]。

准确吸取0.4、0.8、1.2、1.6mL芦丁标准溶液分别置于10mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，以甲醇作空白，在358 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。如图1所示，其线性回归方程为y=30.064x+0.0029（R2=0.9998，y为吸光值，x为总黄酮质量浓度mg/mL）。结果表明，在芦丁质量浓度0.005～0.020mg/mL范围内线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3.2 甜叶菊茎叶中总黄酮的提取和得率

称取甜叶菊渣在一定的条件下提取后，合并滤液并真空浓缩，干燥得粗总黄酮浸膏。取2～3 g粗黄酮浸膏，置于25mL容量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度线[7]。按照标准曲线的制作方法在最大吸收波长处测定吸光度，计算总黄酮得率。

（1）式中m1为黄酮浸膏的质量；m2为原料质量；X为浸膏得率；（2）式中C为样品黄酮质量浓度（mg/mL）,V为样品的体积/25mL；m3为测得率时称取的粗黄酮浸膏质量；Y为总黄酮得率。

1.4 HPLC法测定甜叶菊中黄酮组分含量

HPLC分析条件为：以0.075mmol柠檬酸缓冲液（含0.025mmol乙酸铵，溶液A）和甲醇（溶液B）为流动相，采用甲醇梯度洗脱，洗脱梯度为：0～3min，溶液B≤35%；然后保持35%溶液B不变，洗脱7 min；10～13 min，溶液 B 35%～50%，保持 3min；14～24min，溶液 B 50%～80%，保持 10 min；25～30 min 保持 100%溶液 A 7 min后结束一个循环，检测波长为268 nm，柱温25℃，进样量20μL。按照HPLC保留时间进行样品定性，峰面积积分法进行样品定量。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 FRAP法

取100.0μL提取液与900.0μL Fe+-TPTZ反应液（包括0.3 mmol/L醋酸盐缓冲液25.0 mL；10.0 mmol/L TPTZ溶液2.5mL；20.0mmol/L FeCl3溶液2.5mL混匀，反应10min，以80%乙醇为对照，Trolox为标准，用分光光度计测定595 nm处的吸光值，计算抗氧化活性，以μg/g DW为单位[7]。重复3次。

1.5.2 DPPH法

取100.0μL提取液与 3.9 mL DPPH（60.0μmol/L）混匀，反应6 h，以 VC为对照，以 Trolox当量（TEAC）为标准，用分光光度计测定515 nm处的吸光值，计算抗氧化活性（DPPH·清除率）[12]，重复3次。

DPPH·清除率=（A0-A1）×100/A1（A0代表空白，A1代表样品检测值）

2 结果与分析

2.1 甜叶菊黄酮提取条件优化正交实验结果

对表2、3结果进行直观分析可知：1）RD＞RB＞RC＞RA，影响甜叶菊黄酮物质提取的主次因素为提取功率＞提取温度＞提取时间＞料液比；2）从各因素水平对甜叶菊黄酮物质提取的影响来看，提取功率因素K1D＜K2D＜K3D＜K4D,说明提取功率450W对黄酮提取影响最大；在提取温度这个因素中，K2B＜K1B＜K3B＜K4B，说明高温85℃提取率高；在提取时间因素中 K1C＜K3C＜K2C＜K4C，说明提取时间 150 min 最好；在料液比因素中，K4A＜K1A＜K3A＜K2A，料液比以1∶20为最好；3）由K值可知最佳工艺组合为A2B4C4D4。

表2 甜叶菊茎叶总黄酮提取条件正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results and analysis of extraction conditions of total flavonoids from stems and leaves of stevia

2.2 重复实验

用A2B4C4D4组合的工艺进行了3次重复验证试验，其芦丁提取得率为0.863、0.874和0.885μg/g DW，均值为0.874μg/gDW，总黄酮提取率最高可达到0.88%。高于处理中的次高组合A3B3C2D4，低于处理中的最高组合A2B4C4D4，进一步验证了最佳组合为A2B4C4D4。

表3 甜叶菊茎叶总黄酮提取条件正交试验方差分析结果Table 3 The results of variance analysis of extraction conditions of total flavonoids from stem s and leaves of stevia

2.3 甜叶菊总黄酮类成分的检测

用HPLC法，以柠檬酸-乙酸铵缓冲液和甲醇为流动相，梯度洗脱，检测了圣草枸杞苷、芦丁、山奈素、槲皮素和橙皮苷类黄酮组分的标准品。该检测体系分离效果好、精密度高，对类黄酮物质标准品的检测限（S/N=3）均低于0.05μg/g。利用该体系本研究有效检测了甜叶菊茎叶中黄酮的含量。利用峰面积累计积分法计算得到甜叶菊茎叶中圣草枸杞苷的含量为57.44μg/g，芦丁的的含量为701.42μg/g，山奈素的含量为241.21 μg/g，槲皮素的含量为451.55μg/g，橙皮苷的含量为297.54μg/g。以芦丁的含量为最高，槲皮素的含量其次，山奈素与橙皮苷含量较少，圣草枸杞苷极微。

2.4 甜叶菊抗氧化活性与总黄酮类成分相关性分析

以FRAP和DPPH法检测甜叶菊总黄酮的含量与抗氧化活性的相关性，分光光度法检测其抗氧化活性高达10.02mg/g DW；用甜叶菊中黄酮的总量为横坐标，以抗氧化活性为纵坐标，用抗坏血酸做对照，结果显示，二者呈显著的正相关性。说明甜叶菊中黄酮类物质抗氧化活性随着黄酮含量的增加而增强，见表4。

表4 甜叶菊抗氧化活性与黄酮类含量相关性分析Table 4 Correlation between antioxidant activity and flavonoids content in stevia

3 结论与讨论

3.1 甜叶菊总黄酮类物质提取的条件

正交实验结果表明：影响甜叶菊中黄酮物质提取的主次因素为提取功率、提取温度、提取时间、料液比；最佳提取条件为用80%乙醇提取功率450W，料液比1∶20，提取时间150min，温度85℃，提取3次，依据总黄酮得率计算得到甜叶菊茎叶中黄酮提取率可达到0.88%。该结果与王红玉报道甜叶菊中黄酮的得率（4.21%）低[8]，比方浩斌所测得率（0.62%）高[9]。这可能与甜叶菊的品种、产地、提取条件不同有关。提取条件的优选可为甘肃酒泉甜叶菊黄酮类保健品的开发研究提供基础资料。

3.2 甜叶菊总黄酮类物质的成分

HPLC法检测甜叶菊茎叶中5种黄酮成分，以芦丁的含量（701.42μg/g）为最高，槲皮素含量（451.55μg/g）居其次，橙皮苷含量（297.54 μg/g）与山奈素含量（241.21 μg/g）较少，圣草枸杞苷含量（57.44 μg/g）极微。甜叶菊作为一种重要的糖料作物，在我国已经有了大面积种植，甘肃酒泉肃州区气候干燥、光照充足、昼夜温差大，积温高，十分有利于甜叶菊的生长，其甜菊糖苷、总黄酮的含量较高。其栽培条件、生长环境、品种特性对甜叶菊总黄酮含量和成分的相关性[13]，有待进一步的探索研究。

3.3 甜叶菊总黄酮类抗氧化活性与含量相关性分析

利用FRPD和DPPH法评价甜叶菊茎叶总黄酮类抗氧化活性，发现甜叶菊中总黄酮类物质抗氧化活性高达10.02mg/g DW；综合两种评价方法其黄酮含量与抗氧化活性二者之间呈显著的正相关性 （R=0.769～0.792）。在此基础上，今后研究的重点是开展甜叶菊黄酮的生理功能分子机理探讨，进一步阐明甜叶菊黄酮成分的药理作用，将是甜叶菊黄酮物质研究与综合开发利用的主要方向[14]。近年来，提取甜叶菊糖苷产生了大量的甜叶菊废渣，利用废弃甜叶菊渣提取黄酮类物质的研究，既是甜叶菊产业链延伸的有效途径，又是开发天然、无毒、无副作用植物性功能食品、保健药品的有益探索，具有广阔的开发前景。