甜菜耐盐性分子及育种研究进展

吕春华 ，王宇光 ，於丽华 ，杨瑞瑞 ，耿贵

（1.黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨150080）

0 引言

土壤盐渍化是世界上干旱和半干旱地区最普遍的农业及环境问题之一。截至目前为止，全世界共有15亿公顷耕地，约77 Mhm2（5%）的土地受到过量含盐的影响[1]。在中国，盐渍土的面积约为34Mhm2，占中国陆地面积的3.6%，相当于总耕地面积的三分之一[2]。甜菜（Beta vulgaris L.）是藜科甜菜属，二年生草本植物，广泛种植于中国北部的干旱和半干旱地区，和甘蔗一起被认为是我国两大糖料作物。虽然甜菜是耐盐性较强的经济作物，但近年来随着土壤盐渍化的严重对甜菜产量和质量的影响也越来越大[3-4]。虽然通过合理的水土管理以及地膜覆盖等方法可以减轻盐分对甜菜的危害，但因耗时、费力、见效慢所以实现较困难[5]。因此，深入开展甜菜耐盐性的研究，选育耐盐性甜菜品种，对于扩大甜菜的种植面积、提高盐碱地甜菜产质量都具有十分重要的意义。

1 甜菜耐盐相关基因

近年来，许多参与渗透调节、抗氧化保护酶以及其他功能等方面的耐盐相关基因已经从甜菜植株中获得，而且这些基因对于甜菜在耐盐相关功能方面的特性也得到肯定。

1.1 渗透调节有关基因

1.1.1 脯氨酸合成相关基因

在植物受到逆境胁迫时，脯氨酸是主要的渗透调节剂，其生物合成的前体是谷氨酸，在合成途径中起主要作用的两种关键酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和△1-吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）[6]。Miller等克隆了紫花苜蓿脯氨酸脱氢酶（MsPDH）基因和△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（MsP5CDH）基因，结果显示盐胁迫引起的脯氨酸积累和MsPDH基因的转录水平降低呈正相关[7]。但是关于甜菜在相关基因方面的报道尚少。脯氨酸转运蛋白是植物代谢过程中重要的调控因子，在植物应对非生物胁迫时起重要作用。Yamada报道盐胁迫下甜菜叶柄中脯氨酸转运蛋白（BetT/ProT）不断积累以应对胁迫环境[8]。

1.1.2 甜菜碱合成相关基因

甘氨酸甜菜碱（N,N,N-trimethylglycine，简称甜菜碱）是一种重要的渗透保护剂，是由胆碱单加氧酶（CMO）和甜菜碱醛脱氢酶（BADH）两步氧化反应非生物胁迫合成的[9]。吕笑言等利用PCR克隆获得甜菜M14品系甜菜碱合成相关基因胆碱单加氧酶基因BvM14-CMO和甜菜碱醛脱氢酶基因BvM14-BADH的cDNA全长，荧光定量PCR测试表明盐胁迫下BvM14-CMO及BvM14-BADH在甜菜M14品系的叶片和根系中均显著上调表达[10]。Kent等指出藜科植物如甜菜和菠菜，在盐胁迫下积累甜菜碱，甜菜叶片和根系中BADH的活性随盐浓度从0升高到500mmol/L时都提高了2～4倍，同时可翻译BADH的mRNA水平也呈增加趋势[11]。丝氨酸是在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）存在下由甘氨酸合成，在磷酸化途径中衍生自3磷酸甘油酸（3-PGA），是细胞内甲基化反应中甲基的主要来源[12]，因为合成甜菜碱的过程中需要甲基，所以丝氨酸在提供甲基方面是非常重要的。Kito等探讨了甜菜丝氨酸生物合成基因应对盐胁迫的意义，他们共分离出4种基因，分别是存在于叶绿体中编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因 （BvPGDHa和BvPGDHb）和丝氨酸羟甲基转移酶基因（BvSHMTa和BvSHMTb），结果表明甜菜叶片和根系在盐胁迫条件下，BvPGDHa的mRNA转录表达明显增强，而BvPGDHb的mRNA转录表达明显降低。另一方面，BvSHMTa在盐胁迫下在叶片和根系中短暂表达，而BvSHMTb的表达水平没有改变。盐胁迫后，叶片、叶柄和根系的PGDH活性均显著增加[13]。

1.2 抗氧化保护酶合成相关基因

盐胁迫条件下，甜菜叶片抗氧化酶活性随盐浓度的增加而增加，如过氧化物酶（POX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、交替氧化酶（AOX）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、质体末端氧化酶（PTOX）[14-15]。Hossain等报道盐度导致甜菜植株Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD3、所有AOX亚型、2-Cys-PrxB、PrxQ和PrxIIF的积累。相比之下，Fe-SOD1、1-Cys-PrX、PrxIIB和PrxIIE水平随盐度升高而降低[15]。BVAPX是一种全长cDNA编码的过氧化物酶体抗坏血酸过氧化物酶。Dunajska-Ordak等人通过RT-Q-PCR分析表明，在长期盐度处理条件下，甜菜叶片BvAPX表达显著增加，而在短期盐处理期间BvAPX转录水平仍未受分离叶片的影响[16]。在甜菜基因组中，发现3个AOX基因与拟南芥中的AtAOX1和AtAOX2高度相似，因此命名为BvAOX1A、BvAOX1B和BvAOX2，发现了两个与PTOX具有高同源性的蛋白编码基因，分别命名为BvPTOX1和BvPTOX2。高效协调的上调AOX和PTOX可能代表甜菜在耐盐胁迫过程中的一个特定特征。AtAOX1a的过表达降低了叶片中ROS的形成[17]。在高盐度胁迫条件下，AOX有助于缓解氧化应激[18]。转录上调AOX和PTOX参与抑制盐胁迫甜菜中ROS积累[15]。

1.3 其他功能相关基因

沿海甜菜是一种比糖甜菜耐盐的品种[19]，Uysal等人用功能基因组方法，筛选了先前建立的甜菜cDNA文库，发现了BETA1，BETA1可能在将过量的Na+转运到内膜系统中以降低细胞质中有毒Na+的浓度[20]。孙宗艳利用荧光定量PCR技术对不同时间节点盐胁迫下的甜菜幼苗根叶样品进行miR160/164及其靶基因和抗逆相关PSCS基因的表达量分析，结果表明盐胁迫下PSCS基因的表达与处理时间呈正相关，而miR160/164的表达发生显著下调并遵循一定的时空表达模式，其靶基因的表达均呈显著上调变化[21]。谷丹等对盐胁迫下甜菜采用实时荧光定量PCR技术进行分析，结果表明随着盐胁迫的增大，BvM14-SAMS2基因在叶片中的表达量升高，在根中的表达量不明显，在甜菜M14品系根、茎、叶、花中的表达量为：根＞叶＞花＞茎[22]。张咏雪等对盐胁迫下甜菜M14叶片的3个蛋白质点BvM14-ATPaseF、BvM14-ATPaseH、BvM14-saD经实时荧光定量分析，结果表明，与未处理对照相比，200、400 mmol/L盐浓度处理下BvM14-ATPaseF基因分别上调3.70与4.47倍，BvM14-ATPaseH基因在盐胁迫处理下分别上调0.85与1.36倍，而BvM14-saD基因随着盐浓度的增加下调0.97与2.54倍，表明在盐胁迫下不同基因具有的功能不同[23]。Kanhonou克隆了甜菜蛋白激酶CK2（BvCKA2）的催化亚基在酵母中进行功能表达，表明BvCKA2能够提高酵母对NaCl的耐受性[24]。王鹏等为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用，构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥，结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力[25]。谷丹等报道BvM14-SAMS2基因在甜菜M14品系叶片中受盐胁迫后表达增强，推测该基因可能有利于甜菜植株免受盐胁迫损害[22]。Wu等报道甜菜M14细胞系中BvM14-glyoxalase I基因在细胞解毒和耐受非生物胁迫中起重要作用[26]。赵晨曦报道甜菜M14中BvM14-Tpx基因可提高转基因酵母的抗氧化及耐盐能力[27]。

2 甜菜耐盐性蛋白质组学研究进展

蛋白质组学是研究植物耐盐性，获取植物耐盐基因重要的手段之一。盐胁迫下甜菜成熟叶片中诱导cmRNA亚基明显增加，随着mRNA的增加，V-ATP酶蛋白含量也增加[28]。李金娜从盐胁迫下甜菜M14通过双向电泳和溶液内酶解两个方法获得差异磷酸化蛋白，结果表明，与对照组相比，200 mmol/L NaCl处理有24个差异的磷酸化蛋白，有16个得到成功鉴定，其中有8个磷酸化蛋白上调表达。与对照组相比，400 mmol/L NaCl处理有36个差异的磷酸化蛋白，有28个得到成功鉴定，其中17个磷酸化蛋白上调表达。后将对照组与NaCl处理组的蛋白质样品采用LC-MS/MS进行质谱鉴定，鉴定出189个差异的磷酸化蛋白，94个磷酸化蛋白上调表达，95个磷酸化蛋白下调表达。将以上获得盐应答差异磷酸化蛋白进行功能分类，鉴定出的差异表达磷酸化蛋白参与代谢（16%）、运输（15%）、信号转导和蛋白激酶（14%）、转录（13%）、细胞结构（12%）、胁迫和防御（8%）、蛋白合成（7%）、光合作用（2%）、蛋白折叠和降解（3%）生物过程中[29]。康家宁利用iTRAQ技术对盐胁迫下甜菜M14品系根部膜蛋白质进行定量蛋白质组学分析，得到73个差异表达蛋白，为了进一步研究盐应答膜蛋白，将根部盐应答膜蛋白进行分类，分别是参与运输（32%）、多种生物进程（10%）、信号转导（10%）、胁迫和防御（80%）、能量（8%）、降解（6%）、转录（6%）、代谢（5%）、合成（3%）、细胞结构（1%）和未知（11%）[30]。李鹤男通过对甜菜幼苗进行高盐诱导，经DDRT-PCR技术和银染技术分析，分离出甜菜高盐诱导差异表达的片段共50条，其中上调15条，下调35条，并对Northem杂交呈阳性的序列片段测序后进行BLAST比对分析，共得到12条耐盐相关cDNA片段，涉及叶绿体mRNA及tRNA、SOS信号通路蛋白cDNA、NADH脱氢酶cDNA等[31]。

3 提高甜菜耐盐性的策略

3.1 选育耐盐性甜菜材料

一般而言，不同的甜菜品种其耐盐能力不同，所以，可以通过选育抗盐性较强的甜菜品种（系）来提高甜菜耐盐性。甜菜种子发芽率、盐害系数、幼苗株高、单株叶面积、单株生物学产量、植株含水量等均可做为甜菜芽期耐盐性评价指标。1.0%盐胁迫浓度可作为鉴定甜菜芽期耐盐性的临界浓度，1.8%为甜菜盐胁迫的极限浓度；不同的甜菜品种耐盐性强弱也不同[32-33]。土壤盐渍化越严重，对供试植物的生长抑制作用越大，植株正常生长的临界含盐量是1.2%[34]。於丽华等以146份甜菜种质材料为研究对象，在280 mmol/L NaCl胁迫条件下筛选出耐盐性强弱的材料，再以初选出的材料为研究对象进行复选。结果表明，3份耐盐性弱的材料，分别是82号、25号和268号。同时对市面上出售的48个甜菜品种也进行了初选，筛选出2份耐盐性强的材料STl3092和TDl3829，2份耐盐性弱的材料巴士森和H10474[35]。刘华君等以新疆糖区近年广泛种植的14份甜菜品种为试验材料，在总盐含量9.6 g/kg的中度盐渍化土壤试验田中，对综合保苗率、叶片质膜透性、叶片功能期、含糖率、产量、收获株数6个指标进行评价，初步得出KWS7125和HI0466两品种的耐盐性较好，更适宜在中度盐渍化土壤上种植[36]。

Munns报道耐旱种群也被发现是耐盐的，可能是由于对盐分和干旱胁迫的生理适应相似，因此耐旱性的提高也可能提高盐碱地的产量[37]。Salekdeh等报道标记辅助选择（MAS）候选基因的鉴定可以大大提高甜菜抗旱育种的效率[38]，MAS在提高甜菜耐盐性方面也能发挥重要作用。Abbasi报道分子标记-数量性状联合可用于提高育种效率，特别是耐盐度育种[39]。

3.2 提高甜菜耐盐性的栽培策略

适宜的种植模式、密度、施肥和作物保护等实用的农艺方法是提高盐分胁迫下产量的最有效途径[40]。在盐渍化土壤中，通过地膜覆盖加纸筒育苗移栽或者甜菜纸筒育苗起高垄移栽可提高甜菜的耐盐性[41-42]。另一些天然的植物激素或者自身分泌的物质与植物的抗盐性有一定的关系，外源植物激素处理能明显地改善甜菜的农艺性状及产质量[43]。在盐胁迫下外源脱落酸（ABA）可诱导脯氨酸大量积累，缓解盐分过多造成的渗透胁迫和离子胁迫，维持细胞膜完整性，从而减轻植物受到的盐害[44]。外源赤霉素（GA3）在盐胁迫下提高甜菜种子水分吸收、萌发和幼苗生长[45]。外源水杨酸（SA）可提高盐胁迫下植物根系中CAT和APX活性，降低相对电导率，减少丙二醛（MDA）含量，增强甜菜植株对盐胁迫的适应能力[46]。外源Ca2+可显著提高盐胁迫下植物细胞内多胺含量以及根系中可溶性蛋白的含量，增强根系中谷氨酰胺转移酶（TGase）的活性，缓解植物受到的盐害[47]。芸苔素内酯和诱抗素能够促进植物营养生长和植物的光合作用，提高作物抗逆性[48-49]。

在盐浓度处理下，施加氮肥后甜菜的脯氨酸、可溶性糖、硝酸根离子和钠离子等渗透调节物质积累逐渐增多，渗透调节能力显著提高，同时叶绿素含量、光合速率、蒸腾速率和气孔导度以及单位叶面积的RuBP羧化酶的活性均提高，另外对甜菜的含糖率也有重要影响[50]。外源葡萄糖可以减轻甜菜幼苗生物量下降的趋势，也可以增强甜菜的光合作用，提高可溶性糖、脯氨酸含量和SOD活性[51]。叶面喷施外源甜菜碱能有效提高甜菜幼苗叶片面积、幼苗生物量、叶片相对含水量、甜菜碱含量、叶绿素含量、光合作用和抗氧化能力，另外甜菜幼苗叶片中POX、CAT、SOD、ATPase活性增加[52]。外源脯氨酸比外源甜菜碱更能减轻盐胁迫的危害，因为它具有较强的抗氧化酶活性[53]。在盐胁迫条件下，液泡中的钠可以替代钾的渗透调节功能，增加甜菜叶片的甜菜碱含量和相对含水量，增加叶面积和气孔数量提高甜菜的耐盐性[54-55]。

综上所述，外源脱落酸、赤霉素、水杨酸、Ca2+、芸苔素内酯、氮肥、葡萄糖、甜菜碱、脯氨酸等能够通过增强生理过程提高甜菜的耐盐性（图1），因此在盐碱土种植甜菜时可以通过喷施外源激素或者外源物质以提高耐盐性。

图1 提高甜菜耐盐性的策略Fig.1 Strategies to improve salt tolerance of sugar beet

3.3 转基因方法

耐盐性是受多个盐胁迫反应基因影响的多基因性状，基因工程及其在耐盐育种中的应用是大多数研究项目的目标之一。甜菜液泡Na+/H+反转运基因的过表达显著提高了甜菜的耐盐性[56]。Liu等将拟南芥中耐盐基因AtNHX3转移到甜菜中，结果表明甜菜根系产量和含糖增加，证明AtNHX3增强了转基因植株对高盐度的抗性[57]。采用农杆菌介导法将来源于E.coli的胆碱脱氢酶（CDH）基因和来源于拟南芥的Na+/H+antiport基因导入甜菜细胞可使甜菜耐盐性由1%～1.5%提高到2%～2.5%的NaCl浓度[58]。这些发现表明，通过转基因方法对具有耐盐能力的基因表达的操纵，使不同作物的耐盐性提高并增加作物产质量成为可能。

4 展望

甜菜作为重要的糖料作物，对糖料产业的发展起着重要作用，但严重的土壤盐渍化限制了甜菜的产质量，因此选育耐盐性强的甜菜新品种是目前面临的主要问题。研究者们通过选育耐盐性品种、杂交育种、完善栽培策略以及基因工程技术已经开展了大量的新品种（系）选育工作，虽然利用这些技术已经获得了一些甜菜耐盐材料，但由于周期长、费时、耗力等缺点，这些技术在选育耐盐性品种（系）时受到一定的限制。随着分子生物学的发展，基因工程技术成为研究育种方法热点之一。目前，大量的研究报道利用基因工程技术获得了耐盐性甜菜新品系（品种），但这些研究只是基于实验室或温室中的NaCl胁迫研究，而对于相应品种的地区性研究较少；其次，植物的耐盐性是受多基因控制的性状，但是目前大多数的研究仅关于单基因；另外，目前大多耐盐性探讨的报道都是在转基因品系（品种）的发芽期或幼苗期，但是幼苗期植物的耐盐性是否可以维持并稳定遗传还有待证实。