叶绿素荧光成像在植物生长环境胁迫中的应用

董贞芬 ，门宇恒 ，邹秋滢 ，李征明 ，刘珍珍 ，纪建伟

（1.沈阳农业大学 信息与电气工程学院，沈阳 110161；2.辽宁中医药大学 杏林学院，沈阳 110167）

叶绿素荧光(chlorophyll fluorescence，CF)技术，亦称叶绿素荧光诱导技术，是以叶绿素荧光为探针检测植物光合作用状态分析植物抗胁迫能力的一种技术，是无损获取植物信息的一种有效途径。按获取植物信息的方式，将叶绿素荧光测定分为叶绿素荧光参数技术[1]、快速荧光动力学技术[2]、叶绿素荧光光谱技术[3]和叶绿素荧光成像技术。目前，国内外研究者在作物方面的荧光研究主要集中在前3种技术的分析和利用上，由于植物内部因子分布的不均匀性，经同一种胁迫条件下产生的伤害在空间上也可能是不均匀的，同时可能发生对光合能力和气孔孔径的不均匀影响，从而在同一时间同一片叶上也会展现出不同的荧光活性，为了检测这种异质性分布，荧光成像（chlorophyll fluorescence imaging，CFI）技术应运而生。CFI允许研究整个叶面积上的叶绿素荧光参数的时空非均质性特征。

CFI开创性使用是在1979年，BJÖRN等[4]应用叶绿素荧光成像揭示了对病原体反应不均匀的叶片光合作用相关研究。在LADISLAV等[5]与PAM公司共同研发了第一代叶绿素荧光成像系统FlourCam后成像技术在农业工程中得到了广泛使用。MAXWELL等[6]对叶绿素荧光诱导技术进行总结进一步明确了叶绿素荧光诱导技术在植物检测领域的意义。韩志国等[7]对多种植物叶绿素荧光信息的采集，为国内叶绿素荧光诱导技术的发展起了推进意义。但目前，CFI在植物自然生长环境胁迫中的研究依然占少数[8]。本研究概述了叶绿素荧光成像在植物生长环境温度、光照、水分、营养、盐胁迫研究中的应用，为农业工程中植物环境研究提供了良好的理论基础。

1 叶绿素荧光成像技术

叶绿素荧光技术通过激发光、作用光和测量光的相互交替获取五个关键荧光强度值：F0，F0'，Fm，Fm'和Fs，根据公式计算植物的光化学淬灭，非光化学淬灭以及PS II效率等参数，判断植物光合系统的健康状态、能量转换状态以及植物叶片受光能损害状态等。荧光成像系统在CF基础上，提出了一种从宏观上获取细胞、叶子或植物荧光的方式，在获取荧光参数或光谱的同时也获得了快速、直观和精确的图像信息。荧光成像技术中为了便于观察图像上的异质性，通常使用不同颜色编码、不同数值的伪彩色调色板来逐像素地表示图像中的不均匀性[8]。以发生冷害的番茄幼苗叶片为例，图1为普通相机所采集的图像和蓝光版IMAGING-PAM采集的图像，荧光图像可以检测到普通数码相机无法“看”到的低温损伤。试验中荧光成像技术不仅可以从植物的荧光图像中提取荧光参数、纹理、荧光强度等信息，还能提取颜色相关的信息进行处理并加以分析，最终应用于实际胁迫检测。

图1 番茄叶片的荧光图像Figure 1 The fluorescence image of tomato leaves

2 叶绿素荧光成像技术在植物生长环境胁迫中的应用

在国内叶绿素荧光成像技术应用较少，许多研究是使用CFI来计算所有叶片中给定参数的平均值。目前在作物生长过程中的应用主要为植物病害胁迫的研究[9-11]。自2017年开始，国内才有部分学者开始使用叶绿素荧光成像进行植物生长过程中环境胁迫的研究。国外叶绿素荧光成像技术应用较早，使用范围广泛。国内外在植物环境温度、光照、水分、营养和盐胁迫方面使用CFI的研究介绍如下，研究中所涉及的叶绿素荧光参数及其定为：F0和Fm分别是在暗适应下样品中测量的最小和最大荧光强度，F0'和Fm'分别是由光诱导动力学过程中饱和脉冲法确定的最小和最大荧光强度，Fs是光诱导动力学期间达到的荧光强度稳态值；非光化学淬灭（qN或NPQ，NPQ(T)）是由热耗散引起的荧光淬灭，光化学淬灭（qP或qL）是由光合作用的引起的荧光淬灭，而在当前的光照状态下光系统II的实际光合效率Y(II)=ΦPSII=ΔPSII反映了光合机构目前的实际光能转换效率；Y(NO)=ΦNO代表的是被动的耗散为热量和发出荧光的能量，Y(NPQ)=ΦNPQ代表的是通过调节性的光保护机制耗散为热的能量，光系统II的最大光合效率Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm反映了植物的潜在最大光能转换效率，而Rfd=Fd/Fs=(Fm-Fs)/Fs则反映了叶绿素荧光减少率[8]。

2.1 温度胁迫

在作物生长过程中，温度过低或过高都会影响作物的生长和生产力。为了让植物生长在最佳温度下，有必要知道每个物种或品种的最佳温度范围。而当植物受到低温或高温胁迫时植物的光合作用都会受到影响，因此与光合作用相关的CFI技术可用于监测温度对植物胁迫的影响。

在低温研究中，目前研究多是集中于在其他条件与温度的共同胁迫情况下作物对温度的反应。2007年，HOGEWONING等[12]研究表明，光照条件下低温胁迫在孔雀竹芋斑叶中引起严重的光抑制，测量中Fv/Fm的异质性降低，叶片区域的值较低，叶绿素平均浓度较低，但在黑暗中冷害不会影响PSII效率。2010年，GRAY等[13]使用CFI在4℃冷适应条件下研究低温光合作用中光抑制和随后恢复的响应，并且将非适应植物从23℃冷转移到4℃，研究表明冷适应导致植物对光抑制的耐受性增加，且冷移植物不像冷驯化植物那样宽容，并讨论了PSII修复周期，PSII猝灭中心的作用以及使用CFI监测植物中的光抑制反应。2011年，DEVACHT等[14]使用CFI来评估栽培品种“Hera”的幼株对低温和高光强度的响应，植物在不同的光强度下结合不同的温度（16℃，8℃和4℃）进行光响应测量，量化光系统II的运行效率和非光化学猝灭NPQ的参数对胁迫的严重程度进行评估，结果表明，在幼株的工业菊苣植物中光合系统更容易适应较低的生长温度。同年，LOOTENS等[15]建议将NPQ（光抑制猝灭）作为筛选菊苣植物冷敏感性的有用参数。2015年，HUMPLIK等[16]通过高通量植物表型自动化分析豌豆芽的生物量和光系统效率的耐冷性，实验开发了自动RGB图像分析的新软件，不仅从RGB成像获得的数据相关性来验证，而且从图像获得的数据与非成像叶绿素荧光计测量的叶绿素荧光参数进行比较，证实了所述程序的可靠性。2018年，DONG等[17]使用叶绿素荧光成像系统研究了番茄叶幼苗叶片在低温胁迫下的叶绿素荧光异质性，建议Y(II)作为监测和识别番茄叶片冷敏感性的有用参数，并认为叶绿素荧光图像的直方图和纹理也具有低温胁迫特征。

在高温胁迫下，CO2同化和电子传递受到逐渐抑制，F0增加，Fm和Fv/Fm相对于PSII失活减少。通常，温和的热胁迫导致PSII下调和防止过度光损伤（即刺激非光化学淬灭），强烈的热胁迫抑制了NPQ反应的保护机制。高温胁迫一般伴随着水分胁迫而发展。LANG等[18]测量了烟草叶片中两种胁迫的同时效应，并显示叶绿素荧光发射的梯度。红色（F690）和远红色（F740）叶绿素荧光发射显着增加，叶缘F440/F690和F440/F740比值下降，而叶片中部仍然呈现出规律性光合活性叶片的荧光标记。CHRISTOPH等[19]以20种不同基因型野生大麦的快速叶绿素荧光诱导（OJIP）动力学参数成像观察在热胁迫下对PSII的影响为例，开发了允许叶片进行重复测量荧光的标准化筛选程序，该研究的结果证明叶绿素荧光参数NPQ适合作为筛选热胁迫症状检测的有用参数，且CFI可以表征植物的基因型。

上述温度胁迫从荧光RGB图像的叶绿素荧光参数变化和荧光比值多个方面进行研究，表明植物受温度胁迫后叶绿素平均浓度降低，反应PSII光合能力变化的叶绿素荧光参数Y(II)和NPQ敏感性高，F440/F690和F440/F740比值下降。但大多是进行单一的温度胁迫研究，只有LANG等[18]研究了高温与水胁迫共同发生时的情况。

2.2 光照胁迫

光照是植物生产的关键因素，非适量的光照对作物生长会造成胁迫伤害，因此在温室/田间生产中需要早期检测光胁迫，在细胞发生氧化损伤之前根据植物接收到的日照强度进行适当遮阴或辅助补光。OMASA等[20]开发了一种新的影像仪器系统可以用于定量分析暗光转换过程中叶绿素荧光强度的快速变化，试验中在没有明显损伤的整个单叶上进行动态CFI成像，既显示了光合作用活性的局部变化，也显示了叶绿体中光合电子传递系统的抑制位点。SANDHU等[21]通过测量F680和F740nm等稳定状态荧光图像评估了UV-B辐射（290～320nm）对黄瓜叶片的影响，荧光图像揭示了UV-B胁迫引起的变化，帮助评估UV-B对植物光合组织引起的损伤。MAZZA等[22]认为紫外线辐射造成的损害主要取决于物种或栽培品种，因为栽培品种在叶片紫外线渗透中存在明显的差异，且可以通过CFI进行测量。

TAKAYAMA等[23]开发了一种CFI系统，能够在液氮下捕获叶片的叶绿素荧光图像（F683和F730），F683主要由PSII和捕光复合体II发射，而F730主要由PSI和LHCI发射。试验中芸豆的叶片区域遭遇轻度光胁迫后F683的下降与F730/F683和非光化学淬灭NPQ的增加有关。因此，参数NPQ可以用来评估植物所受轻度胁迫。但是目前NPQ的估算是从叶绿素荧光产量的脉冲幅度调制PAM测量得来的，并且需要测量完全暗适应后材料中的最大荧光产量Fm，在实际应用中会受到条件阻碍，尤其是在成像应用中Fm的测量会受残余光的影响引入假象。TIETZ等[24]为了解决这些限制，对拟南芥叶片进行研究，推导并表征了一组新的参数，NPQ(T)可以在几秒钟内测量，且参数可以在不需要Fm的情况下估算NPQ，实现高通量和现场应用。

上述光照胁迫研究中，评估了紫外辐射对植物的影响，提出紫外线辐射造成的损害主要取决于物种或栽培品种，荧光比率F730/F683可以用于研究叶片表面上的轻度光胁迫，建议参数NPQ用来评估植物所受轻度胁迫，且有研究提出了不受残余光假象影响的新参数NPQ(T)实现现场应用。

2.3 水分胁迫

水资源利用率是植物生产力最重要的限制因素之一，水胁迫能够改变农业作物代谢，延缓生长并抑制植物的光合作用，因此适当监测植物水分胁迫对于开发可持续的作物生产灌溉计划至关重要。MENG等[25]利用叶绿素荧光成像技术研究了烟草叶片的内部水源转换，实验证明快速诱导和碳水化合物输入之间存在相关性，较高的线粒体呼吸可以为卡尔文循环提供CO2。ZARCOTEJADA等[26]对橄榄树和桃园使用荧光成像进行水分胁迫试验，证明了从空气中的图像中提取树木叶绿素荧光的可行性，证明CFI可以作为整个叶面积光合功能指标，同时可以帮助早期识别植物水分胁迫，用于优化灌溉管理。

干旱胁迫也可以通过CFI进行诊断，观察到叶片表面叶绿素荧光的异质性模式。LANG等[27]测定了烟叶F440/F690和F440/F740的线性增加，因为烟叶的相对含水量低于88%～84%，并且他们能够区分完整叶面积中这些比例的局部干扰。LICHTENTHALER等[28]以通过CFI测量豆叶不同部位的光合能力梯度，发现Rfd和Fm/Fs的比值随着水分胁迫的进展而降低。CALATAYUD等[29]在遭受渐进性水分胁迫的玫瑰植物中观察PSII光合能力的时空变化：在时间方面，非光化学过程在水分胁迫的第1天内增加，但随着相对含水量下降非光化学过程减少。这和ΦPSII，qP和qL的逐渐减少ΦNO增加有关；关于空间差异，Fv/Fm，qP和qL在整个叶中是相当均匀的。相反，在整个干旱期（9d），F0和Fm在中脉旁边较高，ΦPSII，NPQ和NO仅在干旱时期的中期表现出空间差异。Fs/F0比率与NPQ和Φ(NPQ）强烈相关，直至RWC为20%。这与光化学猝灭和非光化学猝灭的降低以及ΦNO的增加相一致。SHIHCHIEH等[30]通过获取卷心菜苗叶的荧光图像显影（460nm），结合来源于本研究中猝灭曲线定量模型的动态荧光指数（DFI），建立了一种能够对甘蓝幼苗水分胁迫进行无损评估的动态荧光图像指标体系，使用动态荧光指数预测幼苗水分胁迫状态的定量模型的最佳结果是使用720nm通道r=0.944和SEE=0.286MPa，其中Rfd用于评估荧光减少率。MISHRA等[31]得出结论，CFI可用于鉴定高通量筛选的高耐旱性，以筛选番茄中的抗性基因型。在干旱条件下，诱导胁迫7d后，Fv/Fm，ΔPSII和NPQ在野生型和转基因番茄植物之间产生良好的对比。姚洁妮[32]使用叶绿素荧光动力学和多光谱荧光成像研究拟南芥干旱胁迫响应表型分析，提出基于序列前向选择特征选择法和线性判别分类器可以实现干旱第1，3，8天不同干旱程度拟南芥的分类，野生型拟南芥和突变体拟南芥预测干旱第1，3，8天的平均准确率分别为78.3%和88.3%。周春艳等[33]以460nm蓝色LED为激发光源，融合了叶绿素荧光动力学参数和荧光图像的研究方法，对不同干旱胁迫条件下的植物进行水分胁迫和生长状态信息的观测，对非易失水和易失水叶片分别进行缓慢和快速水分胁迫，实验表明动力学曲线上次峰值出现的时间及荧光比Rfd随着胁迫的加剧均发生变化，确定了水分胁迫下叶绿素荧光图像与时间的关系。

上述研究通过叶绿素荧光成像技术研究植物所受水份的胁迫，表明植物中水份与碳水化合物、F440/F690和F440/F740、Rfd、及PSII光合能力有关，同时CFI不仅可以用于诊断植物的水或旱胁迫，还可以筛选植物中的抗性基因型，为使用叶绿素荧光图像进行植物环境水分胁迫提供理论依据。

2.4 营养胁迫

叶绿素荧光的应用有助于避免过量施肥确保最佳生产力，而目前叶绿素荧光成像研究中对氮（N）和铁（Fe）的研究较多。N是植物发育所需的最大量的营养素，叶中大部分N（50%～80%）在光合作用中起重要作用，N的吸收和叶绿素含量的差异可以通过荧光成像系统进行测量，如高氮供应的甜菜植物可以通过F440/F690和F440/F740值区别于低氮供应的甜菜植物[34]。HEISEL等[35]获得了类似的结果，上述比值的变化归因于在690和740nm处荧光发射的减少。杨一璐等[36]对N营养胁迫做了分析，提取辣椒叶片的25个叶绿素荧光图像的特征参数，对其中18个显著相关(p＜0.01)的特征值用PCA降维至3个有效变量，将结果作为BPNN、GRNN和MLR模型的输入变量，建立辣椒叶片N含量的预测模型。

铁（Fe）是植物的必需元素，Fe的缺失不仅导致光合速率下降，还降低稳态光合作用下实际的光系统II效率。DONNINI等[37]在两种不同的实验条件下确定黄瓜在Fe缺乏条件下测定的叶绿素荧光参数有显著变化，荧光成像有明显的异质性，这表明光合作用过程发生改变。OSÓRIO等[38]发现草莓幼叶叶片叶绿素浓度在Fe胁迫下随着时间的推移逐渐下降，叶绿素荧光图像（Fv/Fm，ΦPSII，NPQ，qP）表现出很大的空间变化，Fv/Fm是受影响的最后一个参数，ΦPSII可以作为早期快速检测Fe胁迫的指标帮助管理施肥。WANSON等[39]通过适当的控制实现在体内实时量化Ca+，pH和ROS的变化，研究可用于可视化的荧光细胞探针遗传编码传感器。

上述N和Fe的研究文献从叶绿素荧光强度比值和图像异质性方向研究植物受胁迫后的情况，叶绿素浓度与胁迫时间呈负相关性，F440/F690和F440/F740值可以用于识别N胁迫的高低，ΦPSII可以作为早期检测Fe胁迫的荧光参数，且提取荧光图像上的特征参数可用于建立胁迫的预测建模。这些研究为进一步实现自动化检测影响胁迫提供了良好的基础。

2.5 盐胁迫

土壤盐渍化是限制作物存活率，降低农产品产量与质量的重要因素之一。盐渍化土壤的改良与利用，能有效缓解世界人口增长与可耕地面积减少等带来粮食产量不足，种植作物种类受限，生态系统遭受破坏等问题。YUAN等[40]采用叶绿素荧光成像技术鉴定了外源腐胺对盐胁迫下黄瓜幼苗光合性能和热耗散能力的影响，试验中盐胁迫降低了Fv/Fm、ΦPSII、qP和qN，并显着增加了ΦNO，喷施外源腐胺在受胁迫的植物上增强了植物调节能量ΦNPQ的耗散并降低了ΦNO。MARIAM等[41]使用高通量表型系统捕获拟南芥植物响应盐胁迫的生长、形态、颜色和光合作用，研究显示在盐胁迫的早期阶段耐盐性与非光化学猝灭过程相关，而在后期阶段植物性能与量子产率相关。RIGÓ等[42]通过测定非破坏性叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSII成像筛选盐、渗透和氧化胁迫耐受性，鉴定了20种拟南芥系在限制条件下具有优异的性能。周鹏等[43]利用叶绿素荧光成像技术研究盐胁迫对柳树叶片光合机构的影响,结果显示盐胁迫下灌木柳Fv/Fm荧光图像变化明显，荧光参数Fv/Fm、Fm和ΦPSII值均显著下降，qP则有所上升，Fo则显著高于对照组。王文森[44]对不同品种的大豆用NaCl进行胁迫，发现在通过气孔限制缓解NaCl胁迫下，苗期大豆叶片的Y(NO)变化不显著，而当主要因素为非气孔限制时(NO)显著提升，且光合系统受损。

上述研究表明盐抑制了植物生长，叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSII降低，在盐胁迫的早期阶段耐盐性与非光化学猝灭过程相关，而在后期阶段植物性能与量子产率相关，当Y(NO)显著提升时已发生严重胁迫损伤。而外源腐胺可缓解盐胁迫诱导的光合作用的不利影响，同时也增强了盐胁迫下叶黄素循环色素的脱环氧化状态，从而提高植物的耐盐能力。

3 结论

本研究展示了CFI在植物生长环境研究中的巨大潜力，CFI能将植物生长环境中的胁迫损伤快速、直观地反映出来，进行筛选植物中的抗性基因型，从而提高植物的抗胁迫能力。CFI可以用作决策支持系统中的传感器，监测受控温室中的植物，尽早鉴定新陈代谢受损和生长受阻的植物，从而避免由于环境胁迫造成的产量损失，同时也避免主观判断，实现准确客观地监测植物健康。因此CFI是植物环境胁迫研究的有力工具，该项目对进一步研究环境胁迫对植物的影响具有重要意义。

尽管CFI在植物生长环境应用中称为一种无损快速的工具，但它还存在一些局限性，例如，由于光吸收的差异，荧光信号的成像可能会被非荧光组织干扰（例如卷曲或表面被灰尘污染的叶子）。而且，目前，大多试验都是进行单一的胁迫研究，很少有同时研究区分两种胁迫的试验，研究中也没有明确的胁迫分级，不利于后期的胁迫调控。未来的工作需要针对两个方向：第一，目前CFI在环境研究中，大都是RGB图像结合叶绿素荧光参数或植物本身的生理参数的研究，可从荧光图像本身的胁迫区域颜色、纹理、面积等特征入手建立不同的胁迫等级。第二，确定影响植物生产的环境因子的最佳范围后，实现不同胁迫类型的自动化识别和环境控制，达到预测和预防的实际生产需求。