民族药四数九里香的化学成分及其细胞毒活性研究

周永福，吴明珠，陈鸿平，刘友平*

1成都中医药大学药学院，成都 611137；2重庆工业职业技术学院化学与制药工程学院，重庆 401120

九里香属植物药资源丰富，全球分布14个种和2个变种；我国有9个种和1个变种[1]，主要分布于海南、湖南、云南等地，药用始记载于《岭南采药录》。现代药理研究表明，九里香属植物药具有增强机体免疫力功能[2]、平喘和祛痰作用[3]、抗菌消炎和麻醉作用[4]、降血糖[5]等作用；民族民间用于胃痛、风湿痹痛、外治牙痛、跌扑肿痛、虫蛇咬伤[6]；现代药物化学研究表明，其主要含有咔巴唑生物碱、黄酮类、香豆素类等[7]。目前关于四数九里香的研究主要集中于其挥发成分，对非挥发部分研究报道较少[8]。

我们采用冷浸渍法对采自于云南华宁的四数九里香进行冷浸、过滤、减压蒸馏、得浸膏；使用硅胶层析柱、凝胶柱色谱、重结晶等方法对浸膏的乙酸乙酯萃取部分进行分离纯化，运用1H NMR、13C NMR波谱方法和文献数据对比，鉴定化合物结构。结果：从四数九里香的叶子中鉴定得到14个化合物：分别为正24烷酸(1)、9,13,17,21-tetramethyl-5-docosenoic acid(2)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-山奈酚甙(3)、补骨脂素(4)、紫苏醛(5)、槲皮素(6)、methyl salicylate glucoside(7)、(9S,10R,11E,13R,15Z)-9,10,13-trihydroxyoctadeca-11,15-dienoic acid(8)、2-isopropyl-5-methylphenol(9)、β-胡萝卜甘(10)、7-羟基香豆素(11)、七叶内酯(12)、β-谷甾醇醋酸酯(13)、山奈酚(14)。除了化合物4、6外、其他化合物为首次从该植物中分离得到。

本研究以肿瘤细胞为研究模型，研究四数九里香多种化学成分对5株肿瘤细胞(白血病HL60、肺腺癌A549、肝癌SMMC7721、结肠癌SW480、乳腺癌MCF7)生长的体外抑制作用。与阳性对照组比较，化合物3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14对白血病HL60显现良好的细胞毒活性，其余化合物的细胞毒活性低于阳性对照组；化合物1～14对肺腺癌A549的的细胞毒活性低于阳性对照组；化合物6、13、14对肝癌SMMC7721显现良好的细胞毒活性，其余化合物的细胞毒活性低于阳性对照组；化合物1、2、3、6、7、9、11、12对乳腺癌MCF7显现良好的细胞毒活性，其余化合物的细胞毒活性低于阳性对照组；化合物1～14对结肠癌SW480的细胞毒活性低于阳性对照组。

1 仪器及材料

400 MHz型核磁共振仪(TMS为内标、瑞士bruker公司)；柱层析硅胶GF254(200～300目、青岛海洋化工公司)；Sephadex LH-20,ODS2A(50 μm,日本YMC/维美希公司)；二氧化碳培养箱(济南鑫贝西生物技术有限公司)、多功能酶标分析仪(MULTISKAN FC)；乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇均为工业纯，减压蒸馏使用。

药材于2016年2月采自云南省华宁县，经成都中医药大学陈新博士鉴定为芸香科九里香属四数九里香M.tetramera Huang的枝叶。植物标本(标本编号：20160122001)保存于重庆工业职业技术学院中医药物研究所；5株细胞购自于中国科学院昆明植物研究所细胞库。

2 提取与分离

四数九里香叶35 kg，晾干、粉碎、60%的乙醇溶液，常温、常压浸提(5×10.0 L×3,2周提取一次)、浓缩、合并，得浸膏2.8 kg，温水溶解，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、浓缩得石油醚萃取部分200 g、乙酸乙酯萃取部分680 g、正丁醇萃取部分460 g。

用硅胶色谱柱(200～300目、10 cm×150 cm)对乙酸乙酯萃取部分进行分离、分别用石油醚∶乙酸乙酯(20∶1→18∶3→16∶5→14∶7→12∶9→10∶11→8∶13→6∶15→0∶21)为流动相进行洗脱，经TLC检测后合并得39个组分：A1→A39。A5(94 g)经过乙酸乙酯溶解、以1∶30(质量比)的比例上正相硅胶柱(200～300目、8 cm×150 cm)，分别用二氯甲烷：乙酸乙酯(10∶1→9∶1→8∶1→7∶1→6∶1→5∶1→4∶1→3∶1→1∶1→0∶1)为流动相进行洗脱，经TLC检测后合并得20个组分：A5-1、A5-2、A5-3、A5-4、A5-5、A5-6、A5-7、A5-8、A5-9、A5-10～A5-20；A5-1(10.1 g)上正相硅胶柱(3 cm×50 cm)，合并相同成分、分成五段：F1-5；F1上葡聚糖凝胶柱(3 cm×120 cm)纯化、得化合物1(21.0 mg，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯=5∶1，Rf=0.59)和化合物2(23.4 mg，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.74)；F2上正相硅胶柱(2 cm×50 cm)纯化、得化合物5(78.5 mg，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.62)；F3上正相硅胶柱(2 cm×50 cm)纯化、得化合物8(45.7 mg，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.63)；F4上正相硅胶柱(2 cm×50 cm)、葡聚糖凝胶柱(3 cm×120 cm)进行纯化、得化合物9(29.1 mg，展开剂为：石油醚：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.64)；A5-3(5.6 g)上正相硅胶柱(2 cm×50 cm)，合并相同成分、分成三段：S1-3；S1多次使用甲醇重结晶、纯化、得化合物4(52.0 mg，展开剂为：石油醚：丙酮：乙酸乙酯=1∶1∶1，Rf=0.65)；S2上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)得化合物10(7.2 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.67)；S3上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)制得化合物11(31.2 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.57)；A5-7(8.1 g)上正相硅胶柱子(3 cm×50 cm),合并相同组分、合成六段：Z1-6；Z1上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)、葡聚糖凝胶柱(3 cm×120 cm)纯化得化合物3(36.1 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.61)和化合物6(23.5 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.69)；Z2上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)、葡聚糖凝胶柱(3 cm×120 cm)纯化得化合物7(10.2 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.55)和化合物12(25.4 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.65)；Z4上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)、葡聚糖凝胶柱(3 cm×120 cm)纯化得化合物14(21.2 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.60)；Z5上正相硅胶柱子(2 cm×50 cm)，重结晶得化合物13(16.1 mg，展开剂为：丙酮：乙酸乙酯=1∶1，Rf=0.68)。

3 结构鉴定

化合物1无定型粉末 (CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:7.29 (1H,s,OH),2.35 (1H,d,J=7.5 Hz,H2-2a),2.20 (1H,d,J=7.5 Hz,H2-2b),1.65 (3H,dd,H2-3),1.61 (24H,br,s,12xCH2),0.84 (3H,t,J=6.5 Hz,Me-16);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:180.03 (C-1),33.87 (C-2),31.94 (C-4),29.71 (CH2),29.68 (CH2),29.61 (3xCH2),29.46(2xCH2),29.38 (CH2),29.26 (CH2),29.06 (CH2),24.72 (CH2),22.71(CH2),14.14(C-26) 。以上数据与文献[9]对照基本一致，故鉴定为正24烷酸。

化合物2油状;1H NMR(400 MHz,CD4O) δ:7.26 (1H,s,OH),5.29-5.41 (4H,dd,H-5,H-6),2.76-2.82 (4H,q,J=7.5 Hz,H-2),2.36 (2H,m,H-3),2.35 (2H,s,J=7.5 Hz,H-4),2.33 (3H,dd,H-7),2.08 (2H,q,H-8),2.06 (2H,q,H-9),2.04 (2H,q,H-10),2.02 (2H,q,H-11),2.00 (2H,q,H-12),1.69 (6H,br,s),0.90 (6H,t,Me-13,Me-17);13C NMR(CD4O,100 MHz) δ:179.85 (C-1),129.94 (C-5),127.59 (C-6),36.65 (C-2),34.41 (C-13),31.93 (C-17),31.79 (C-9),31.53 (C-10),30.93 (C-21),29.69 (C-18),29.66 (C-14),29.65 (C-15),29.59 (C-16),29.53 (C-19),29.44 (C-20),29.37 (C-22),29.36 (C-23),29.33 (C-11),29.25 (C-12),29.15 (C-24),29.07 (C-25),29.03 (C-7),27.98 (C-8),27.21 (C-4),27.19 (C-3),25.63 (C-26),25.53 (C-29),24.67 (C-27),19.61 (C-28),13.94 (C-30)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定为9,13,17,21-tetramethyl-5-docosenoic acid。

化合物3黄色粉末(C5H5N);1H NMR(400 MHz,py) δ:8.74 (d,J=8.5 Hz,H-3′,H-5′),7.63 (d,J=8.5 Hz,H-2′,H-6′),7.16 (d,J=2.0 Hz,H-6),6.93(d,J=2.0 Hz,H-8),6.04(d,J=7.4 Hz,Glc-1),4.31,4.22,4.15,3.98(葡萄糖基氢信号);13C NMR(100 MHz,py) δ:187.94 (C-4),174.45 (C-7),171.41 (C-5),170.09 (C-4′),167.39 (C-2),166.93 (C-9),143.77 (C-3),141.50 (C-2′,C-6′),131.45 (C-1′),125.74 (C-3′,5′),114.53 (C-10),111.69 (C-6),109.34 (C-8),Glc:104.37 (C-1),87.32 (C-5),86.57 (C-3),84.51 (C-2),80.04 (C-4),71.17 (C-6)。以上数据与文献[11]对照基本一致，故鉴定为3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-山奈酚甙。

化合物4无色针状(CHCl3);1H NMR(400 MHz,CDCl3) δ:6.48 (d,J=9.58 Hz,H-4),6.97 (dd,J=2.4 Hz,H-3′),7.33 (s,H-8),7.79 (s,H-5),7.94 (d,J=2.4 Hz,H-2′),7.98 (d,J=9.60 Hz,H-3);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:100.43 (C-8),107.73 (C-11),115.48 (C-3),116.72 (C-10),121.57 (C-5),126.01 (C-6),145.48 (C-4),148.49 (C-12),153.23 (C-9),157.40 (C-7),161.73 (C-2)。以上数据与文献[12]对照基本一致，故鉴定化合物为补骨脂素。

化合物5油状;1H NMR(400 MHz,CD4O) δ:9.45 (H-1),6.86 (H-3),4.75 (d,H-9),4.73 (d,H-9),2.47 (s,H-4),2.34 (d,H-7),2.12 (d,2H,H-6),1.89 (s,H-5),1.75 (s,H-8),1.45 (d,H-6);13C NMR(CD4O,100 MHz) δ:20.86 (C-10),24.34 (C-9),27.11 (C-8),31.40 (C-7),40.10 (C-6),109.43 (C-5),129.78 (C-4),141.88 (C-3),148.79 (C-2),172.64 (C-1)。以上数据与文献[13]对照基本一致，故鉴定化合物为紫苏醛。

化合物6黄色粉末(C5H5N);1H NMR(400 MHz,Py) δ:6.17 (1H,s,H-6),6.36 (1H,s,H-8),6.87 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),7.61 (1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),7.72 (1H,s,H-2′);13C NMR(Py,100 MHz) δ:95.26 (C-8),100.07 (C-6),105.33 (C-10),116.83 (C-2′),117.06 (C-5′),122.52 (C-6′),124.96 (C-1′),138.03 (C-3),147.03 (C-3′),148.79 (C-2),149.58 (C-4′),159.00 (C-5),163.27 (C-9),166.35 (C-7),178.11 (C-4)。以上数据与文献[14]对照基本一致，故鉴定化合物为槲皮素。

化合物7白色晶体(C5H5N);1H NMR(C5D5N,400 MHz) δ:7.66 (1H,br,d,ca,J=8.0 Hz,H-3),7.37 (1H,t,J=8.0 Hz,H-4),7.01 (1H,J=8.0 Hz),7.83 (1H,br,d,J=8.0 Hz),5.52 (1H,d,J=7.0Hz,H-1′),4.35 (1H,dd,J=7.0,8.0 Hz,H-2′),4.33 (1H,dd,J=8.0,8.0 Hz,H-3′),4.29 (1H,dd,J=8.0,8.0Hz,H-4′),4.11 (1H,m,H-5′),4.36 (1H,dd,J=5.0,12.0 Hz,H2-6′),4.55 (1H,br,d,ca.J=12 Hz,H2-6′),3.73 (3H,s,1-COOCH3);13C NMR(C5D5N,100 MHz) δ:51.80 (1-COOCH3),62.16 (C-6′),70.90 (C-4′),74.81 (C-2′),77.92 (C-3′),78.89 (C-5′),103.12 (C-1′),117.40 (C-3),121.70 (C-1),122.00 (C-5),131.13 (C-6),133.71 (C-4),157.71 (C-2),166.88 (1-COOCH3)。以上数据与文献[15]对照基本一致，故鉴定化合物为methyl salicylate glucoside。

化合物8油状;13C NMR(CDCl3,400 MHz) δ:14.52 (C-18),21.91 (C-17),23.69,26.05 (C-3),26.43,26.59 (C-7),30.15 (C-4),30.38 (C-5),30.53 (C-6),33.10 (C-8),34.93 (C-14),38.29 (C-2),73.00 (C-13),75.76 (C-9),76.50 (C-10),126.35 (C-15),131.02 (C-12),134.33 (C-16),136.51 (C-11),177.67 (C-1)。以上NMR数据与文献[16]对照基本一致，故照鉴定化合物结构为(9S,10R,11E,13R,15Z)-9,10,13-trihydroxyoctadeca-11,15-dienoic acid。

化合物9油状;13C NMR(400 MHz,CDCl3) δ:1.24 (6H,5-CH(CH3)2),2.24 (3H,2-CH3),3.68 (1H,5-CH(CH3)2),6.64(1H,d,J=7.6 Hz,H-4),7.06 (1H,d,J=7.6 Hz,H-3),7.71 (1H,H-6),8.19 (1H,-OH);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ:22.00 (C-5,CH3),24.00 (C-2′,3′),28.16 (C-1′),117.52 (C-6),121.80 (C-4),127.30 (C-3),133.11 (C-2),137.34 (C-5),155.57 (C-1)。以上NMR数据与文献[17]对照基本一致，故鉴定化合物为2-isopropyl-5-methylphenol。

化合物10片状(C5H5N);1H NMR(Py,400 MHz) δ:8.73 (1H,s,H-*),7.58 (1H,s,H-*),7.21 (1H,s,H-*),5.36 (1H,s,H-*),5.07 (2H,d,J=8.0,H-*),5.00 (4H,s,H-*),4.57 (1H,d,H-*),4.31 (1H,d,H-*),4.30 (2H,s,H-*),4.08 (1H,s,H-*),4.00 (2H,s,H-*),4.57 (1H,d,H-*);13C NMR(py,100 MHz) δ:12.37 (C-18),12.55 (C-26),19.40 (C-19),19.60 (C-29),19.81 (C-21),20.37 (C-28),21.68 (C-25),23.78 (C-15),26.77 (C-22),29.85 (C-12),30.65 (C-27),32.45 (C-8),32.57 (C-7),36.78 (C-2),37.32 (C-1),37.87 (C-23),39.73 (C-20),42.87 (C-10),46.43 (C-16),50.73 (C-4),56.63 (C-24),57.22 (C-13),72.08 (C-3),葡萄糖基碳信号：63.23 (C-6′),75.73 (C-5′),78.49 (C-4′),78.88 (C-3′),79.00 (C-2′),102.97 (C-1′),122.31 (C-6),141.30 (C-5)。其核磁共振与β-谷甾醇进行对比，发现比β-谷甾醇多一个葡萄糖基碳信号，以上数据与文献[18]对照基本一致，故鉴定化合物为β-胡萝卜甘。

化合物11雪花状(CH3COCH3);1H NMR(C3D6O,400 MHz) δ:10.58 (1H,s,-OH*),7.91 (1H,m,J=8.0,J=8.0,H-4),7.51 (1H,m,J=8.0,J=8.0,H-8),6.77 (2H,m,J=8.0,J=24.0,H-5,6*),6.19 (1H,m,J=8.0,J=8.0,H-3);13C NMR(C3D6O,100 MHz) δ:102.21 (C-8),111.32 (C-10),111.44 (C-5),113.16 (C-3),129.73 (C-6),144.54 (C-4),155.55 (C-9),160.49 (C-7),161.34 (C-2)。以上NMR数据与文献[19]对照基本一致，故鉴定化合物为7-羟基香豆素。

化合物12黄色片状(CH3COCH3);1H NMR(C3D6O,400 MHz) δ:7.86 (1H,d,J=8.0 Hz,H-4),6.98 (1H,s,H-5),6.75 (1H,s,H-8),6.16 (1H,d,J=8.0 Hz,H-3);13C NMR(C3D6O,100 MHz) δ:102.69 (C-8),110.79 (C-10),111.52 (C-5),112.35 (C-3),142.95 (C-6),144.48 (C-4),148.56 (C-9),150.49 (C-7),160.88 (C-2)。以上NMR数据与文献[20]对照基本一致，故鉴定为七叶内酯。

化合物13白色晶体(CH3OH,C5H5N);1H NMR(400 MHz，CD4O) δ:7.26 (1H,s,-OH),5.35 (3H,d,H-6),3.52 (1H,dd,H-3),2.17 (7H,s,H-8),1.84 (7H,m,H-9),1.00 (3H,s,H-19),0.92 (3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.85 (3H,d,J=7.0 Hz),0.83 (3H,d,J=6.9 Hz),0.81 (3H,d,J=6.8 Hz),0.68 (3H,s,H-18);13C NMR(CD4O,100 MHz) δ:11.87 (C-18),11.99 (C-26),17.47 (C-19),19.04 (C-29),19.40 (C-21),19.83 (C-28),21.09 (C-25),23.07 (C-15),24.31 (C-22),25.59 (C-12),28.26 (C-8),29.15 (C-7),31.65 (C-2),31.91 (C-1),33.95 (C-23),36.15 (C-20),36.51 (C-10),37.26 (C-16),39.78 (C-4),42.29 (C-24),45.84 (C-13),50.14 (C-9),56.06 (C-17),56.77 (C-14),70.49,71.83 (C-3),121.75 (C-6),140.76 (C-5),162.91.与谷甾醇对比，多2个碳原子(1个季碳，1个甲氧基)。以上NMR数据与文献[21]对照基本一致，故鉴定为β-谷甾醇醋酸酯。

化合物14黄色无定型粉末(C5H5N);1H NMR(py,400 MHz) δ:8.15 (2H,d,J=9.0 Hz,2,6′-H),7.01 (2H,d,J=9.0 Hz,4,5′-H),6.55 (1H,d,J=3.0 Hz,8-H),6.24 (1H,d,J=3 Hz,6-H);13C NMR(py,100 MHz) δ:94.16 (C-8),98.99 (C-6),104.25 (C-10),116.12 (C-3′,5′),123.11 (C-1′),130.37 (C-2′,6′),137.40 (C-3),147.35 (C-2),157.33 (C-9),160.40 (C-4′),162.20 (C-5),165.20 (C-7),177.01 (C-4)。以上NMR数据与文献[22]对照基本一致，故鉴定为山奈酚。

4 细胞毒活性研究

把培养液(含10%胎牛血清的RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3 000～15 000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，细胞提前12～24 h接种培养；化合物用DMSO溶解，单体化合物以40 μM浓度初筛，每孔终体积200 μL，每种处理均设3个复孔。37 ℃培养48 h后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20 μL和培养液100 μL；悬浮细胞弃100 μL培养上清液，每孔加20 μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20 μL和培养液100 μL的混合液)，继续孵育2～4 h，使反应充分进行后，在492 nm波长下，采用功能酶标仪(MULTISKAN FC)测定各孔光吸收值，记录结果。

细胞抑制率=(A对照-A样品)/(A对照-A空白)

每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性对照化合物，根据细胞抑制率计算法计算各化合物对细胞的抑制情况。筛查结果见表1。

表1 化合物1～14的肿瘤细胞毒活性初步测试结果

5 讨论

九里香属植物四数九里香MurrayatetrameraHuang具有抗炎症，抗生育、抗甲状腺等作用。本实验通过色谱技术从中分离制得14个单体化合物，采用现代波谱分析方法鉴定了它们的结构，分别为6个黄酮类化合物、2个甾体化合物、5个香豆素类化合物和1个不饱和脂肪酸酯；其中有12个化合物为首次从该植物中分离制得。以肿瘤细胞为研究模型，研究四数九里香多种化学成分对5株肿瘤细胞(白血病HL60、肺腺癌A549、肝癌SMMC7721、结肠癌SW480、乳腺癌MCF7)体外生长的抑制作用。研究表明：化合物3～8、10～14对白血病HL60显现良好的细胞毒活性；化合物1～14对肺腺癌A549的的细胞毒活性低于阳性对照组；化合物6、13、14对肝癌SMMC7721显现良好的细胞毒活性；化合物1～3、6、7、9、11、12对乳腺癌MCF7显现良好的细胞毒活性；化合物1～14对结肠癌SW480的细胞毒活性低于阳性对照组。该研究结果为四数九里香抗肿瘤细胞活性提供了物质基础和数据及理论支持，为进一步研究开发民族民间药物四数九里香和相关的抗肿瘤新药提供了坚实的基础。

致谢：本实验在核磁实验部分得到云南民族大学民族医药学院李干鹏教授课题组的大力支持，在此处一并表示感谢。