HPLC同时测定大叶冬青叶中10种多酚成分的含量及抗氧化活性研究

王存琴，陈 颖，汪 雷，崔巧玉，段名扬，陈国军

皖南医学院药学院，芜湖 241002

大叶冬青(IlexlatifoliaThunb.)，为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)常绿乔木，主要生长在海拔900 m以下的沟谷常绿阔叶林中，在我国安徽、江苏、浙江、江西、福建、湖南、广西、广东等地均有分布[1]。药用其叶，常于秋冬二季采收。大叶冬青主要含有多酚类、三萜及其皂苷、挥发油等化学成分[2-8]。作为苦丁茶的主要来源之一，大叶冬青可用于治疗口齿疼痛、热性痢疾、目赤肿痛、热病烦渴等症[9,10]。现代研究表明，抗氧化作用是大叶冬青的主要药理活性之一，其作用的主要物质基础是所含的多酚类成分[12-18]。然而，目前大叶冬青叶中多酚类成分的含量测定研究甚少，尤其缺乏同时测定大叶冬青叶中多种多酚类成分含量的方法，相关质量评价标准的缺乏，影响了大叶冬青的开发和利用；同时，大叶冬青叶抗氧化作用与多酚类成分含量之间的相关性研究未见报道，影响了大叶冬青的药用质量和安全。本课题组拟在前期研究工作基础上[2-7,11]，建立HPLC同时测定大叶冬青叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 10种多酚类成分的定量分析方法，并以大叶冬青抗氧化活性为检测指标，初步探讨不同产地大叶冬青叶抗氧化活性与10种多酚类成分总含量间的相关性，从药效和含量两方面全面评价大叶冬青药材的质量，以便较为全面地反映大叶冬青药材的品质，为其质量标准的建立和临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ(配二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器)(安捷伦科技有限公司)，Agilent HC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司)，AUW220D型1/10万电子天平(日本岛津)，RHP-400A型高速多功能粉碎机(浙江永康市荣浩工贸有限公司)，KQ5200E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，GKC型数显控温水浴锅(上海波络实验设备有限公司)。

1.2 材料

新绿原酸(批号PS13122601-1，纯度大于98.00%)、绿原酸(批号PS14050901，纯度大于98.50%)、隐绿原酸(批号PS14011403，纯度99.06%)、咖啡酸(批号PS161221-01，纯度大于98.00%)、芦丁(批号PS160113-02，纯度大于等于95.00%)、异槲皮苷(批号PS13061301，纯度99.77%)、异绿原酸B(批号PS13111502，纯度大于98.50%)、异绿原酸A(批号PS13111501，纯度大于98.00%)和异绿原酸C(批号PS13110401，纯度大于98.50%)对照品均购自成都普思生物科技有限公司；对羟基肉桂酸(批号D-032-161216，纯度大于等于98%)购自上海乔羽生物科技有限公司。色谱乙腈(德国，默克股份有限公司)，色谱甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水为娃哈哈饮用纯净水，磷酸(天津市福晨化学试剂厂)，乙醇(无锡市苏强化工有限公司)，DPPH(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)。

实验用大叶冬青药材23批，于2017年实地采集，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌副教授鉴定为冬青科冬青属植物大叶冬青I.latifolia的叶，见表1。标本均保存于皖南医学院药学院。选择其中来自不同产地的5个批次大叶冬青叶，分别是第3、7、11、13、14号进行抗氧化活性试验(见表5)。

表123批药材产地、采收时间表

Table 1 Sources of 23 batches of sample from different producing areas and harvest times

编号No.来源Source采收时间Harvest timeS1安徽南陵县2017.10S2安徽南陵县2017.10S3安徽南陵县2017.10S4安徽石台县2017.10S5安徽石台县2017.10S6安徽石台县2017.10S7安徽石台县2017.10S8安徽石台县2017.10S9安徽石台县2017.10S10安徽石台县2017.10S11广西南宁市2017.10S12广西南宁市2017.10S13安徽祁门县2017.10S14安徽芜湖市2017.01S15安徽芜湖市2017.03S16安徽芜湖市2017.05S17安徽芜湖市2017.06S18安徽芜湖市2017.07S19安徽芜湖市2017.08S20安徽芜湖市2017.09S21安徽芜湖市2017.10S22安徽芜湖市2017.11S23安徽芜湖市2017.12

2 方法与结果

2.1 HPLC同时测定大叶冬青叶中10种多酚类成分的含量

2.1.1 色谱条件

采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)进行梯度洗脱，洗脱程序：0～15 min，10% A；15～16 min，10%～16% A；16～30 min，16% A；30～31 min，16%～18% A；31～50 min，18 % A；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长320 nm；进样量为10 μL。在上述色谱条件下，供试样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C色谱峰的保留时间与对照品保持一致。对照品溶液和供试样品溶液HPLC图(见图1)。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品新绿原酸10.92 mg，绿原酸18.36 mg，隐绿原酸10.92 mg，芦丁29.80 mg，异槲皮苷5.08 mg，异绿原酸B 11.28 mg，异绿原酸A 5.82 mg，异绿原酸C 4.06 mg，咖啡酸2.08 mg，对羟基肉桂酸1.60 mg混合置于20 mL容量瓶中，用50%甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得混合对照品储备溶液。质量溶度分别为0.546、0.918、0.546、1.490、0.254、0.564、0.291、0.20、0.104、0.08 mg/mL，4 ℃冷藏保存备用。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取不同产地大叶冬青叶粗粉约2.0 g(过4号筛)，分别置250 mL具塞锥形瓶中，加50%甲醇125 mL，称定重量，80 ℃超声提取50 min，放冷，再称定重量，加50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液50 mL，水浴蒸干，用适量50%甲醇转移至10 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

图1 对照品(A)与样品(B)HPLC图Fig.1 Chromatograms of reference standards (A) and Sample (B)注：1新绿原酸、2绿原酸、3隐绿原酸、4咖啡酸、5对羟基肉桂酸、6芦丁、7异槲皮苷、8异绿原酸B 、9异绿原酸A、10异绿原酸C。Note:1 neochlorogenic acid,2 chlorogenic acid,3 cryptochlorogenic acid,4 caffeic acid,5 p-hydroxycinnamic acid,6 rutin,7 isoquercitrin,8 isochlorogenic acid B,9 isochlorogenic acid A,10 isochlorogenic acid C.

2.1.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品储备溶液适量，用50%甲醇稀释成不同浓度的对照品溶液，按照2.1.1项下的色谱条件测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的峰面积，平行测定3次，求得峰面积平均值，以对照品浓度(mg/mL)的常用对数为横坐标(X)，色谱峰面积的常用对数为纵坐标(Y)，绘制标准曲线,结果见表2。

表2 大叶冬青叶10种酚酸类成分线性关系(n=6)

续表2(Continued Tab.2)

化合物Compounds回归方程Regression equation 相关系数r线性范围Linear range(μg/mL) IsoquercitrinY=1343.4X-2.527 20.99987.82～254.00Isochlorogenic acid BY=2866.7X-18.8940.999917.35～564.00Isochlorogenic acid AY=3211.6X+10.690.99998.95～291.00Isochlorogenic acid CY=3384.3X-5.336 10.99996.25～203.00

2.1.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积，计算相对应的RSD，得出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C对应峰面积的RSD分别为0.33%、0.12%、0.12%、0.11%、0.12%、0.18%、0.09%、0.22%、0.22%和0.21%，表明仪器精密度很好。

2.1.6 重复性试验

精密称取同一样品(S13)，按2.1.3项下方法平行制备6份供试品溶液，照2.1.1项下色谱条件，分别进样10 μL，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的色谱峰面积，计算平均质量分数分别为0.17%、0.75%、0.23%、0.003 7%、0.001 8%、0.50%、0.072%、0.060%、0.049%、0.068%，其RSD分别为0.91%、0.77%、1.02%、4.46%、4.54%、2.57%、1.64%、2.35%、2.58%、1.73%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验

精密称定大叶冬青药材粉末约2.0 g，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，照2.1.1项色谱条件操作，分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样分析，记录峰面积。结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C对应峰面积的RSD分别为1.27%、1.18%、2.90 %、1.43%、1.04%、1.40%、0.97%、1.08%、1.84%、2.66%。说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的大叶冬青样品(S13)6份，精密加入对照品适量，按2.1.3项所述的制备方法制备供试品溶液，照2.1.1项条件进行含量测定，计算10种成分的平均回收率及RSD，结果见表3。10种待测的成分的平均回收率在96.58%～112.03%，RSD均小于4.0%，表明方法的回收率良好。

表3 大叶冬青叶中10种成分的质量分数及对应RSD(n=6)

续表3(Continued Tab.3)

化合物Compounds样品中量Amount in sample(mg)加入量Amount added(mg)测的量Measured quantity(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Average recovery rate(%)RSD (%)隐绿原酸4.54752.10006.6965100.7499.810.87Cryptochlorogenic acid4.46322.10006.555599.894.50602.10006.6675100.934.41762.10006.477099.384.40492.10006.441599.024.46362.10006.490598.89咖啡酸0.07100.40250.4812101.64101.571.03Caffeic acid0.07470.40250.4794100.460.07560.40250.4820100.810.07950.40250.4862100.870.07120.40250.4866102.700.07410.40250.4907102.96对羟基肉桂酸0.03820.30750.3858111.60112.033.26P-hydroxycinnamic acid0.03710.30750.3614104.870.03600.30750.3896113.390.03370.30750.3872113.490.03380.30750.3897114.170.03670.30750.3946114.64芦丁9.92445.730015.6700100.10100.520.38Rutin9.84275.730015.6275100.359.79155.730015.5365100.109.19485.730015.0670100.959.78695.730015.6420100.819.44505.730015.2950100.79异槲皮苷1.41290.97552.4825103.85103.891.02Isoquercitrin1.45460.97552.4860102.221.43720.97552.4925103.231.36410.97552.4480104.551.40370.97552.5055105.231.39080.97552.4700104.29异绿原酸B1.22952.17003.5625104.79107.521.86Isochlorogenic acid B1.22582.17003.5785105.371.17472.17003.6115107.981.15222.17003.5925108.141.16042.17003.6355109.161.17192.17003.6655109.68异绿原酸A0.99561.12002.050596.93101.333.60Isochlorogenic acid A0.99451.12002.056597.230.95961.12002.1265102.26

续表3(Continued Tab.3)

化合物Compounds样品中量Amount in sample(mg)加入量Amount added(mg)测的量Measured quantity(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Average recovery rate(%)RSD (%)0.92911.12002.0965102.320.92551.12002.1785106.500.95881.12002.1355102.72异绿原酸C1.27600.78252.1715105.49100.483.25Isochlorogenic acid C1.26230.78252.0605100.761.42090.78252.133096.801.34260.78252.059596.921.34800.78252.1645101.601.40640.78252.2180101.32

2.1 .9 样品含量测定

按2.1.3项下方法制备供试品溶液，照2.1.1项色谱条件进行测定，记录峰面积，用外标法计算23批大叶冬青药材中10种化合物的含量，见表4，图2和图3。

表4 23批大叶冬青叶药材中10种成分的质量分数

续表4 23批大叶冬青叶药材中10种成分的质量分数

2.2 DPPH法测定大叶冬青叶的抗氧化活性

DPPH在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，典型的用于抗氧化成分的体外抗氧化活性评价[19]。本实验选择广泛用于定量测定生物试样和食品抗氧化能力的DPPH法进行大叶冬青叶的抗氧化活性测定。

2.2.1 溶液的制备

DPPH·乙醇溶液：精密称取DPPH粉末9.85 mg至250 mL棕色容量瓶中，加200 mL无水乙醇，超声30 min后加无水乙醇定容至刻度，摇匀，分别制成0.10 mmol/L的DPPH·乙醇溶液。避光，备用。

大叶冬青样品溶液:①供方法学考察，取大叶冬青粉末约0.6 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液200 mL，称定重量，80 ℃超声提取50 min，放冷，再称定重量，加50%甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液100 mL，水浴蒸干，定容至50 mL容量瓶中，作为大叶冬青储备液，质量浓度6.0 g/L(药材)。②供活性测定，分别取不同体积的大叶冬青储备液，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，制成药材质量浓度分别为5.40、4.80、4.20、3.60、3.00、2.40、1.80、1.20 g/L(药材)的安徽南陵产大叶冬青50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为1.05、0.90、0.75、0.60、0.45、0.30 g/L(药材)的安徽芜湖产大叶冬青50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为1.80、1.50、1.20、0.90、0.60、0.30 g/L(药材)的安徽石台产大叶冬青50%甲醇提取液，药材质量浓度分别为1.80、1.50、1.20、0.90、0.60、0.30 g/L(药材)的安徽祁门大叶冬青50%甲醇提取液和药材质量浓度分别为0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 g/L(药材)的广西南宁大叶冬青50%甲醇提取液，备用。③空白样品溶液，取6 mL无水乙醇与1.0 mL 50%甲醇溶液，置15 mL具塞刻度试管中，混匀，即得。

2.2.2 测定方法[20]

取0.10 mmol/L DPPH·乙醇溶液6 mL，置15 mL具塞刻度试管中，分别加入不同浓度大叶冬青样品溶液1.0 mL，摇匀，反应65 min后，将6 mL无水乙醇与1.0 mL 50%甲醇溶液作为空白组，6 mL DPPH·乙醇溶液与1.0 mL 50%甲醇溶液作为对照组。在紫外-可见分光光度计517 nm波长下测定其吸光度，并计算自由基清除率。自由基清除能力计算公式如下：清除率=[1-(Asample-Ablank) /Acntrol]× 100%。

2.2.3 抗氧化能力的测定

分别取不同产地的大叶冬青药材，按2.2.1项下方法制备大叶冬青50%甲醇溶液，照2.2.2项下方法进行测试，得到不同药材浓度下各溶液的吸光度，并计算清除率及IC50值(见表5)。

表5 不同产地大叶冬青抗氧化能力测定

2.2.4 大叶冬青抗氧化能力与10种多酚类成分含量相关性初步分析

结合表4和表5分析，5批不同产地大叶冬青样品中10种多酚成分总含量较高者，对应IC50相应较低，其抗氧化活性相对较好，其中安徽芜湖一月份采集样品中总多酚含量最高，抗氧化活性最好，IC50值最低。广西南宁采集样品10种多酚成分总含量比安徽石台样品含量略低，但其抗氧活性优于安徽石台样品，通过对这两个产地大叶冬青叶10种多酚类成分含量比对发现，广西南宁样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸三者含量均高于安徽石台样品。进一步分析5批不同产地(3、7、11、13、14号)大叶冬青叶中10种多酚类成分含量差异，结果显示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸三者含量高者抗氧化活性好。据此推测，大叶冬青叶抗氧化能力大小与10种多酚成分总含量有关，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸三者含量对大叶冬青叶抗氧化能力大小影响较大。

3 结论

本文建立了HPLC同时测定大叶冬青叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、对羟基肉桂酸、芦丁、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C 10种多酚类成分含量的方法。以10种多酚类成分总含量和浸出物含量为考察指标，比较不同超声时间(30、50、80 min)，不同提取溶剂(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水)，不同超声温度(30、60、80 ℃)对提取效率的影响，最终选择50%甲醇为提取溶剂，温度为80 ℃，提取时间50 min作为供试品的最佳提取条件。考察YMC-ODS C18、Agilent HC-C182种型号色谱柱对各待测成分的分离效能，结果表明Agilent HC-C18色谱柱可以获得较为平稳的基线，且各待测成分峰形和分离度较好，保留时间较稳定。比较了甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸水溶液系统的分离效果，结果表明，以0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在流速1.0 mL/min的情况下，10种化学成分出峰时间在50 min以内，并与相邻峰的分离度良好。比较了各待测成分在280、320、328 nm处吸收情况，结果表明10种成分在320 nm处有较大吸收，且色谱图的基线较为平稳，故选择320 nm作为检测波长。

通过建立的该方法对不同产地、不同采收期的23批大叶冬青样品中10种多酚类成分的含量进行测定，结果显示，10种多酚类成分总含量主要以新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸为主，不同产地、不同采收时间大叶冬青叶中10种多酚类成分的含量总和存在一定差异。同时采自10月份的5个不同产地样品比较发现，采自安徽石台和广西南宁的样品中总多酚含量较高，其次是安徽芜湖、安徽祁门和安徽南陵。比较了采自安徽芜湖不同采收时期的10批大叶冬青样品，其中6批样品(采收时间：8、9、10、11、12、1月)总多酚含量高于其他月份采集样品，说明大叶冬青叶适合秋冬季节采收，此时有效成分累积达到高峰。

对大叶冬青叶抗氧化活性与10种多酚类成分总含量相关性分析发现，大叶冬青50%甲醇提取液抗氧化活性与10种多酚类成分总含量基本呈正相关，其中新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸三者与抗氧化活性成正相关，可能是大叶冬青抗氧化活性的主要有效成分。

综上所述，单独从多酚类化合物的含量不能准确评价大叶冬青药材的质量情况。将抗氧化活性测定与总多酚含量测定结果两方面相结合，可更加全面反映大叶冬青药材的质量。此外，目前对大叶冬青药材质量标准的研究很少，缺乏相关的质量控制标准，影响到大叶冬青药材临床应用的安全性和可靠性。因此，本实验的研究可为大叶冬青药材质量标准的制定提供科学依据。