辣椒CaNAC61基因的克隆与表达分析

王 莹，林 多，杨延杰，王莉月，马 静

(青岛农业大学园艺学院，青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东 青岛 266109)

【研究意义】辣椒(CapsicumannuumL.)作为一种重要的蔬菜和工业加工原料，年种植面积持续稳定在147万平方公顷以上，是我国种植面积最大的蔬菜作物之一[1]。由于辣椒整个生育时期受外界环境影响较大，环境因素成为限制产量和品质的主要因素，例如高温、干旱、盐碱等非生物胁迫都会致使产量和品质下降[2]。因此对辣椒NAC家族CaNAC61基因进行克隆与表达分析，对辣椒耐盐新品种的研究具有重要意义。【前人研究进展】NAC转录因子家族是近年来发现的植物特有的一类转录因子[3]，该家族基因的N端含有高度保守的氨基酸序列[4]，C端序列高度多样化，能转录激活或抑制其活性。NAC参与植物生长发育的多个过程，如植物的开花、次生壁的形成、叶片衰老等过程[5]，很多研究结果表明，NAC参与干旱、高盐、低温等非生物胁迫，其转录表达可以明显提高植物的抗性。在水稻中，过表达OsNAC5、OsNAC9和OsNAC10，可以提高水稻的产量及其对干旱胁迫的抗性[6-7]。在拟南芥中，AtNAC072和AtNAC019是ABA信号通路的关键基因，AtNAC072的表达受高盐、脱落酸、乙烯等多种因素诱导并参与植物的信号传导，AtNAC019的表达受ABA、热、高盐、干旱应答等因素诱导，并调节植物生长发育[8-10]。【本研究切入点】鉴于NAC基因在植物逆境中的重要作用，前期结合对辣椒NAC家族的基因表达和功能研究的基础上，从NCBI数据库中获得CaNAC61基因，采用同源序列法从辣椒中克隆出目的基因。【拟解决的关键问题】本研究中以‘青农干椒2号’和‘青农干椒8号’为试验材料，利用 RT-PCR方法，克隆得到CaNAC61基因的全长片段，进行生物信息学分析，并对蛋白质理化性质和结构等进行预测，采用RT-PCR技术分析干制辣椒在不同胁迫下的表达模式，为深入研究辣椒NAC基因功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验材料选用‘青农干椒2号’和‘青农干椒8号’六叶期幼苗，由青岛农业大学干制辣椒育种课题组提供。植物总RNA提取试剂盒购自天根(上海)生化科技有限公司；反转录试剂盒购自宝生物生物技术(北京)有限公司；DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒载体pMD19-T simple Vector购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物合成和DNA测序由青岛擎科梓熙科技技术有限公司完成。

干制辣椒材料种植于植物生长室，待辣椒苗长至6到7片叶，对正常植株进行6种处理，分别用100 μM PEG、MEJA、SA、ABA溶液、200 mM NaCl和38 ℃高温进行处理，设置未做任何处理的植株为对照，每处理3次生物学重复。分别在处理3、6、12 h取植株的根、茎、叶各0.1 g，取样完成后放入液氮保存，对辣椒的叶片进行总RNA的提取及cDNA的合成。

表1 实验所用引物

1.2 CaNAC61基因的克隆

总RNA提取和cDNA合成按照天根公司的RNA试剂盒和宝日医公司的 pMD 19-T simple vector试剂盒操作说明完成。根据辣椒的CaNAC61基因设计1对引物，分别为CaNAC61-F和CaNAC61-R(表1)。PCR扩增体系及方法参考王莉月等的方法[11]，采用 20 μl体系。将扩增产物使用1 %琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目标片段，连接pMD19-T simple Vector载体，经转化大肠杆菌、阳性克隆后，送至青岛擎科梓熙科技技术有限公司测序，并用BioXM 2.6软件验证结果。

1.3 CaNAC61基因的生物信息学分析

利用DNAMAN 软件获得基因编码序列；利用MEGA 7.0软件构建系统进化树；用DNAMAN进行氨基酸序列的多重比对[12-13]；利用Prot Scale程序(https://expasy.org/cgibin/protscale.pl)完成蛋白质疏水性分析[14]；利用Prot-Param软件进行理化性状分析[15]；利用SWISS-MODEL工具进一步预测蛋白三级结构，并模拟蛋白结构[16]。

1.4 CaNAC61基因的表达分析

使用LightCycler 480 II qRT-PCR检测系统进行实时定量PCR反应。根据扩增的CaNAC61序列设计表达检测引物，分别为CaNAC61-F1和CaNAC61-R1(表1)。使用 LightCycler®480 SYBR Green I Master试剂盒，操作按说明书进行。实时定量PCR反应体系及方法参考王莉月等方法[11]。采用20 μl体系，反应体系设置为dd H2O 7 μl，SYBR Green I Master 10 μl，PCR Forward Primer (10 μM) 1 μl，PCR Reverse Primer (10 μM)1 μl，DNA模板1 μl。反应体系为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃；40 ℃ 10 s。以Actin-F和Actin-R(表1)作为内参，每个反应设置3个对照，使用Excel软件进行不同组织内表达水平的分析，基因相对表达量采用2-△△Ct法[17]进行计算。

2 结果与分析

2.1 CaNAC61基因的克隆与序列分析

以青农干椒2号和8号品种的cDNA为模板扩增目的基因，得到2个均在800 bp左右的片段(图1)。结果表明两个辣椒品种中的CaNAC61均含有一个全长885 bp的开放阅读框(ORF)，编码294个氨基酸(图2)。

M: BM2000 DNA marker; 1:‘青农干椒 2 号’; 2:‘青农干椒 8 号’BM2000 DNA marker; 1: ‘Qingnong dried pepper No. 2’; 2: ‘Qingnong dried pepper No. 8’图1 CaNAC45 基因 PCR 扩增Fig.1 PCR amplification CaNAC45 gene

2.2 多序列比较和系统进化树分析

利用DNAMAN 软件对CaNAC61与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)ATAF亚家族NAC蛋白进行序列比对，由图3可得，CaNAC61具有特征性N端和C端区域即N端具有多个高度保守序列，而C端是高度多变的转录激活调控域，由此可得，CaNAC61具有NAC转录因子ATAF亚家族的典型特征，表明CaNAC61属于ATAF亚家族。

为了分析CaNAC61的亲缘关系，将干制辣椒与烟草(Nicotianatabacum)；向日葵(Helianthusannuus)；辣椒(Capsicumannuum)；菠菜(Spinaciaoleracea)；可可(Theobromacacao)等植物的蛋白序列比对显示(图4)，氨基酸序列被聚为两大类，马铃薯、番茄、辣椒、烟草的亲缘关系最近，与鹰嘴豆、绿豆、大豆、蓖麻等其他物种在进化上的亲缘关系较远；推测CaNAC61基因的功能可能与马铃薯、番茄、烟草的功能相似。

图2 CaNAC61基因的核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino sequences of CaNAC61 gene

黑色背景表示氨基酸序列完全一致，灰色背景表示氨基酸序列出现保守替换The black background indicates that the amino acid sequence is completely consistent, and the gray background indicates the conservative substitution of the amino acid sequence图3 辣椒NAC61的氨基酸多序列比较Fig.3 The alignment of amino acid sequences of NAC from pepper

图4 辣椒CaNAC61转录因子亚族的进化树Fig.4 Phylogenetic tree of CaNAC61 from pepper and other plants

表2 其他植物的NAC蛋白氨基酸组分及理化性质分析

图5 辣椒CaNAC61蛋白疏水和亲水性预测Fig.5 Predication of hydrophobic and hydrophilic properties of CaNAC61 from pepper

2.3 氨基酸组分及理化性质分析

将CaNAC61转录因子蛋白与另外14种植物NAC转录因子进行氨基酸组成成分及理化性质分析。结果显示干制辣椒CaNAC61的蛋白质相对分子量为33.67 kD，理论等电点为6.26。干制辣椒和其他14种植物的NAC蛋白氨基酸数在289～303，酸性蛋白。在干制辣椒CaNAC61和15种其他植物NAC蛋白中，脂肪族氨基酸比例大于芳香族氨基酸比例(表2)。

干制辣椒CaNAC61蛋白由22种氨基酸组成，其中，脯氨酸(Pro)含量最高，为9.5 %，半胱氨酸(Cys)含量最低，为 1.7 %；脂肪族系数(Aliphatic amino acid)为67.69 ；不稳定系数为54.98；亲水性平均系数为-0.660，表现为亲水性(图5)。

2.4 二级和三级结构预测与分析

将CaNAC61利用SOPMA在线工具上进行二级结构预测，结果显示CaNAC61编码的294个氨基酸中，α螺旋占 35.75 %，β转角占6.74 %，无规则卷曲有39.38 %。采用在线工SWISS MODEL对CaNAC61蛋白同源建模，进而预测其三级结构(图6)。

2.5 干制辣椒CaNAC61基因在不同逆境中的表达分析

为研究干制辣椒CaNAC61对非生物胁迫的响应，本实验采用荧光定量PCR技术检测CaNAC61基因在不同胁迫(100 μM PEG、MeJA、SA、ABA溶液、200 mM NaCl溶液、38 ℃高温)处理下，不同处理时间(0、3、6、12 h)的基因相对表达水平变化。从图7可知，CaNAC61基因在不同胁迫处理下均有一定程度的影响，其中，CaNAC61基因在NaCl、干旱处理3 h时，相比对照，分别为6.62和4.24倍，表达量显著升高；12 h时表达量达到最低水平，分别为4.28和0.20倍；在高温、SA和ABA处理中，CaNAC61基因随着时间的增加表达量呈上升趋势，胁迫处理12 h时表达量达到最高水平，分别为0.80、3.74、1.37倍；在MeJA中表达量则无显著变化。随着时间的推移CaNAC61基因在盐和干旱处理中呈下调趋势，而在高温、SA和ABA处理中，随时间推移呈下调趋势，而MeJA处理则无显著变化。在6种非生物胁迫处理中，CaNAC61在NaCl条件下诱导后表达量显著升高，因此，CaNAC61基因在应答盐胁迫中发挥着重要作用。

图6 CaNAC61蛋白三级结构预测Fig.6 The three-dimension structure prediction of CaNAC61 protein

不同小写字母表示在同一时间段不同胁迫处理下差异显著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences under different stress treatments at the same time(P<0.05)图7 辣椒NAC61基因在不同逆境中的表达水平Fig.7 Expression levels of NAC61 transcription factor gene of pepper plant in different abiotic stress treatments

3 讨 论

在植物抗逆反应过程中，NAC家族发挥着重要作用。对NAC基因生物信息学方面的研究可以促进对NAC家族生物学功能的研究。本文通过对CaNAC61基因进行氨基酸比对和多重序列分析表明，该转录因子是NAC家族的成员之一。辣椒的CaNAC61基因与马铃薯、番茄、辣椒、烟草亲缘关系较近，而与绿豆、可可、木椿等作物亲缘关系较远，这符合植物各科属在进化中的关系，而与番茄、烟草等亲缘关系较近，表明CaNAC61基因与茄科模式植物功能的相似性，这为以后研究CaNAC61的功能提供了参考依据。通过对CaNAC61编码的氨基酸进行结构预测，表明二级结构主要由α螺旋、β转角和无规则卷曲构成；通过与不同植物的NAC蛋白的理化性质分析，推测该蛋白为亲水性蛋白。与辣椒CaNAC45分析结果一致[11]。在蛋白质三维结构模型中，多个螺旋结构围绕反向平行结构形成NAC结构域，这符合典型的NAC转录因子三维结构特征[2]。

转录因子作为一种重要的响应因子，能够快速应答和调控相关基因的表达以提高植物的抵抗能力[21]。近年来已经有大量的文献证实，NAC家族转录因子在许多植物如拟南芥[22]、水稻[23]中的过表达能够显著提高转基因植物的抗逆性。将小麦TaNAC2基因转入拟南芥后，DREB2A、ABI2、ABI5和RD22等基因的共表达可以提高对非生物胁迫的抗性[24]。CaNAC61基因在非生物胁迫和激素处理下的表达分析显示，6种处理下均有响应，表明6种处理均能诱导CaNAC61的表达量，其中NaCl处理表达显著，其次干旱处理较为显著；分别在3 h表达量达到最高水平，12 h表达量最低，表达量随时间的推移呈先升高增加后降低趋势；而水杨酸和茉莉酸甲酯处理与对照相比，整体上呈先升高后降低趋势，并随时间推移再次增加，他们的表达量分别在12和6 h达到最高水平，对热处理和脱落酸处理则变化不显著；CaNAC61基因对盐胁迫具有显著的响应作用，这表明CaNAC61在提高辣椒的耐盐性方面起着重要作用，这对进一步研究辣椒耐盐品种提供理论依据；水杨酸和茉莉酸甲酯诱导CaNAC61基因的表达量提高，但不如盐胁迫处理效果显著，有研究表明棉花GhATAF1基因通过调控ABA、JA、和SA等信号，使其在非生物和生物胁迫中发挥重要作用[25]，这表明CaNAC61基因可能与水杨酸和茉莉酸甲酯诱导有关，但具体的作用机制需要进一步深入研究。综上所述，CaNAC61可能参与调节植物非生物胁迫响应变化，下一步将从功能方面对其进行深入研究。

4 结 论

本试验通过克隆获得干制辣椒CaNAC61基因，对该基因编码的氨基酸序列组成、理化性状、蛋白质结构等，使用相关软件对其编码的氨基酸序列进行分析，获得ORF全长，编码294个氨基酸；同源性比对和进化树分析表明CaNAC61是NAC转录因子家族ATAF亚家族成员之一。进一步研究了CaNAC61在高盐、干旱、高温、SA、MeJA和ABA胁迫下的响应。对其胁迫下的相关表达量进行了分析，结果表明该基因在各种非生物胁迫下上调较为显著，表明该基因可能在植物抗逆方面具有重要作用。下一步将通过功能等方面对该基因进行进一步验证，以期为增强植物抗逆性奠定基础。