不同益生菌干预对高脂饮食诱导肥胖小鼠脂代谢及脂多糖影响的研究

方圆圆,吴 亚,陈彦辉,王建青,杨琍琦

(安徽医科大学第二附属医院 儿科,安徽 合肥230000)

肠道菌群失调与肥胖和代谢紊乱密不可分[1-3]，肠道菌群通过神经、内分泌、代谢和免疫等途径与大脑进行双向调节，能够影响宿主对食物的摄取[4]。益生菌以乳酸杆菌和双歧杆菌为代表[5]，益生菌治疗的出现有望纠正由肥胖导致的宿主相关代谢紊乱[6]。尽管益生菌对人体有益的分子机制尚不明确，但部分肠道菌群确可改善肥胖及其引起的相关代谢性疾病，这有可能与益生菌改善了肠道菌群优势菌的分布从而增强上皮屏障功能，调节宿主免疫反应有关[7，8]。但目前有相关研究表明，并不是所有的益生菌均可有效降低体重，改善机体代谢紊乱的情况，甚至部分益生菌还有可能增加体重和脂肪含量[9-11]。本研究旨在探讨儿科临床上常用的两种益生菌在不同的剂量下对于高脂饮食诱导的离乳期至性成熟前期肥胖小鼠的体重、相关脂代谢指标及脂多糖含量的影响，并动态检测同组小鼠相关指标变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养108只3周龄雄性清洁级C57BL/6小鼠，体重11-13 g，由北京维通利华实验动物公司提供。标准饲料及高脂饲料均由南通特洛菲饲料科技有限公司提供。将实验动物随机分为6组：正常饮食对照组(NFD组，n=18)，高脂饮食组(HFD组，n=18)，高脂饮食+低剂量婴儿双歧杆菌干预组(HFD+LB组，n=18，含菌量为1×108CFU/ml)，高脂饮食+高剂量婴儿双歧杆菌干预组(HFD+HB组，n=18，含菌量为1×109CFU/ml)，高脂饮食+低剂量酪酸梭菌干预组(HFD+LC组，n=18，含菌量为1×107CFU/ml)，高脂饮食+高剂量酪酸梭菌干预组(HFD+HC组，n=18，含菌量为1×108CFU/ml)。各组在原有饮食基础上，对照组及高脂饮食组给予生理盐水灌胃处理，高脂饮食+益生菌干预组给予不同剂量益生菌混悬液灌胃处理，灌胃体积按照100 μl/10 g小鼠体重计算。各组均自由饮食，连续饲养5周，每天灌胃1 次。灌胃期间，每1 d称量小鼠体重1 次，根据体重变化及时调整灌胃量。所有小鼠实验期间自由摄食及饮水，控制环境温度(22±2℃)和湿度(55%±10%)，明暗周期12 h。

1.2 菌种及实验室制剂本研究菌种由山东科兴生物科技公司提供，婴儿双歧杆菌菌粉含菌量为1×1011CFU/g，酪酸梭菌菌粉含菌量为1×109CFU/g，使用无菌生理盐水配制成婴儿双歧杆菌含菌量为1×108CFU/ml、1×109CFU/ml，酪酸梭菌含菌量为1×107CFU/ml、1×108CFU/ml的混悬液分别进行灌胃。总胆固醇(TC)、 甘油三酯(TG)、 低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。脂多糖(LPS)试剂盒购自武汉基因美生物技术有限公司。

1.3 血脂相关指标检测分别于饲养第一周末，第三周末，第五周末剖杀小鼠，每组每个时间点随机剖杀六只，留取血液样本，采用酶比色法按照试剂盒操作说明进行分析，应用全自动生化分析仪进行检测。

1.4 脂多糖检测分别于饲养第一周末，第三周末，第五周末剖杀小鼠，每组每个时间点随机剖杀六只，留取血液样本，采用酶联免疫分析法按照试剂盒操作说明进行分析，通过标准曲线计算样品中小鼠LPS浓度。

2 结果

2.1 不同益生菌对高脂诱导肥胖小鼠体重的影响

由表1可以看出，各组之间在起始体重上并无显著差异(P>0.05)。各组小鼠在最终体重上均低于HFD组，且有统计学差异(P<0.05)，同时饲养第一周末，HFD+HC组小鼠体重相较于NFD、HFD、HFD+LC组已出现差异(P<0.05)。第三周末，益生菌干预各组小鼠与HFD组小鼠体重差异均有统计学意义(P<0.05)，HFD+LB、HFD+LC组在第五周末终体重上明显高于NFD组，差异有统计学意义(P<0.05)。HFD+LB、HFD+HB组间小鼠体重于第五周末组间差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组小鼠体重的比较

注:与NFD对比，aP<0.05，与HFD对比，bP<0.05，婴儿双歧杆菌高低剂量组间对比，cP<0.05，酪酸梭菌高低剂量组间对比，dP<0.05。下同。

2.2 不同益生菌对高脂诱导肥胖小鼠血脂成分的影响

与NFD组相比，于饲养第一周末后检测HFD组血清中TC、TG 、LDL含量均明显增高(P<0.05)，HDL含量明显降低(P<0.05)。益生菌干预各组与HFD组相比，至饲养第五周末血清中TC、TG 、LDL含量均明显增高(P<0.05)，HDL含量明显降低(P<0.05)。同时动态检测小鼠血清中各成分的含量，TC大致呈先增高，后降低，再增高趋势，TG、HDL大致呈先增高，后降低趋势。见表2-5。

表2 血清TC的比较

表3 血清TG的比较

表4 血清HDL的比较

表5 血清LDL的比较

2.3 不同益生菌对高脂诱导肥胖小鼠脂多糖的影响

与NFD组相比，从饲养第一周末开始，HFD组小鼠脂多糖升高明显 ，且有统计学意义(P<0.05)，益生菌干预各组与HFD组相比，至饲养第五周末血清中LPS含量均明显降低(P<0.05)。同时血清中LPS动态变化也大致呈先增高，后降低，再增高趋势。见表6。

表6 血清LPS的比较

3 讨论

研究发现，肥胖以及一些代谢性疾病可能与炎症反应有关。造成代谢异常的主要原因，是失衡的肠道菌群产生的脂多糖等内毒素进入人体，被免疫细胞识别后产生多种炎症因子，使得机体进入低度炎症状态，从而产生代谢异常。例如，若长期进食高脂食物，可造成肠道菌群中革兰阴性菌株的数量增多，导致肠道内脂多糖的大量生成，同时菌群比例的失调可引起肠黏膜中紧密连接蛋白ZO-1、occludin变化，从而导致肠道通透性的增加，继而增加了脂多糖的吸收，导致炎症反应，造成肥胖[12，13]。双歧杆菌及嗜酸乳杆菌已被多项研究证实确能改善高脂饮食诱导肥胖动物的肥胖指数、血脂紊乱及胰岛素抵抗相关指标[14-17]。同时亦有研究表明，酪酸梭菌制剂在防治各种肠道疾病和部分肠道外疾病都是有比较显著的效果，同时Hua等[18]研究发现，酪酸梭菌能刺激Th1 免疫反应，有效激活的单核细胞和DC 从而诱导和维持组织Treg 细胞，下调促炎性细胞因子和上调抗炎细胞因子，可改善机体炎症状态，除此之外，酪酸梭菌的代谢产物还能促进肠上皮细胞的再生和修复，可有效减少脂多糖的吸收。

本研究中，高脂饮食组与对照组第三周末体重有差异，从第三周末开始，益生菌干预各组体重明显低于高脂饮食组，有统计学差异，说明益生菌能够改善高脂饮食造成的肥胖。同时高低剂量益生菌干预组间对比发现，第一周末酪酸梭菌组间即出现差异，第五周末婴儿双歧杆菌组间出现差异，表明不同剂量的益生菌对于改善肥胖的程度不一，本研究中，高剂量益生菌干预组效果总体优于低剂量益生菌干预组。从血清中各组脂类分析中可以看出，高脂饮食组小鼠较对照组小鼠，TC、TG 、LDL含量均明显增高，HDL明显降低，说明高脂饮食能够导致小鼠血液中的脂代谢异常，而益生菌干预后，各项指标有所好转，但仍高于对照组，说明益生菌能够改善小鼠血液中脂代谢情况，但尚未能完全恢复正常。对于高低剂量益生菌干预组间对比发现，婴儿双歧杆菌组间TC、LDL最终含量有差异，低剂量婴儿双歧杆菌干预组TC含量低于高剂量婴儿双歧杆菌干预组，而LDL呈现相反结果。酪酸梭菌干预组间TC、LDL最终含量无明显差异。而TG、HDL含量在益生菌干预组间均有差异，高剂量益生菌干预组TG均明显低于低剂量益生菌干预组，而婴儿双歧杆菌干预组中低剂量干预组HDL含量高于高剂量组，酪酸梭菌组间则相反，说明不同益生菌虽可改善小鼠脂代谢异常，但益生菌的种类和剂量不同致各项指标改善的程度不一。对比同组小鼠不同阶段脂代谢各项指标变化可以看出，小鼠各项脂代谢指标改变有明显的趋势。从血清中各组LPS含量分析中可以看出，第一周末开始，高脂饮食组小鼠血清LPS含量即高于对照组，而益生菌干预各组LPS含量均明显降低，说明益生菌干预后能改善机体炎症状态，对比同组小鼠不同阶段LPS变化可以看出，小鼠LPS改变亦有明显的趋势，结合上述结果，说明益生菌干预小鼠肥胖有最优剂量与干预时间段。

本研究的创新之处在于选取离乳期小鼠进行干预饲养至性成熟前期，模拟儿童生长发育过程，再一次证明益生菌干预对于改善高脂饮食诱导的肥胖有效果，不同种类益生菌在不同剂量下对于肥胖个体改善的效果有差异，并且对于各项脂代谢指标的改善有侧重性，同时动态检测同组小鼠不同阶段相关脂代谢指标及脂多糖的变化，提示在益生菌干预下相关指标有趋势变化。本研究对于指导临床应用益生菌干预儿童肥胖起到了很好的借鉴作用，但仅选取了两种临床常用益生菌，种类偏少，后期可进一步扩大研究范围，同时可进一步研究出益生菌干预后相关指标的变化趋势，为临床用药疗程做指导。