高效薄层色谱扫描法同时测定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合欢素含量

蔡玉茹， 江 倩， 李洒洒， 冯顺丽， 周国梁

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

滁菊(Chrysanthemummorifoliumcv.‘Chuju’ )为菊科植物菊的干燥头状花序，为安徽滁州地区的道地药材[1]。在2015年药典中将滁菊与亳菊、贡菊、杭菊、怀菊作为药用菊花同园收录，为现有具有药食两用的药用植物之一[2]。滁菊味辛、甘、苦，性微寒，具有清肝明目、疏散风热等功效，对于肝阳上亢引起的眩晕具有较好的治疗效果[3-4]。研究表明滁菊对大鼠心肌缺血具有较好的保护作用[5-6]，能够提高大鼠耐疲劳作用[7]，具有较好的抗氧化性[8]，对DPPH具有较好的清除作用[9]。

滁菊现常作为一种健康保健食品，但市场流通的滁菊质量差异较大，对其质量进行分析和确定有重要意义[10-11]。采用总成分已经不能对其质量差异进行有效评估，对其质量成分分析现多采用HPLC法进行定量分析[12-13]，但因其样品前处理方法复杂，耗费时间长，多样品的分析显然不能够满足现有的食品快速检测分析质量管理要求[14-16]。高效薄层色谱扫描法(HTLCS)能够采用薄层对成分进行分离，并通过扫描对其测定成分定量分析，能够对多个样品同时进行分析，且分析方法简便，能够快速对滁菊成分进行定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LINOMAT5半自动点样仪(瑞士CAMAG公司)；TLC VISALIZER 薄层色谱成像文件系统(瑞士CAMAG公司)；TLC SCANNER 3薄层色谱扫描仪(瑞士CAMAG公司)；GF254薄层硅胶板(青岛海洋化工有限公司)；DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)；SHZ-DⅢ循环水真空泵(郑州英峪予华仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)；ZNHW-Ⅱ电热套(郑州科华仪器设备有限公司)；CP225D准微量天平(德国赛多利斯公司)；JK-250DB数控超声波清洗器(合肥金尼克机械制造有限公司)；双槽层析缸(上海信宜仪器厂)。

木犀草素对照品(批号：1309-08),芹菜素对照品(批号：15032610),均购于中国食品药品检定研究院；金合欢素对照品(批号：20170612，上海诗丹德科技生物有限公司)；甲醇等试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。滁菊购于安徽滁州菊泰有限公司，批号：201708，经安徽科技学院中药学教研室刘汉珍教授鉴定为正品滁菊。

1.2 高效薄层扫描法

1.2.1 供试品溶液的配制 精密称取滁菊1.000 g，剪碎，加石油醚(30～60 ℃) 20 mL超声处理30 min，滤过，药渣挥发加稀盐酸1 mL与乙酸乙酯50 mL超声处理30 min滤过，滤液水浴蒸干，得到的残渣加甲醇2 mL使其溶解，转移到5 mL容量瓶中摇匀，作为供试品溶液。

1.2.2 对照品溶液的配制 精密称取适量标准品，加甲醇配成浓度为木犀草素0.2 mg/mL、芹菜素0.2 mg/mL、金合欢素0.2 mg/mL，精密分别量取上述3种成分的标准品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，添加甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，即可得不同浓度的混合对照品溶液。

1.2.3 薄层层析及薄层扫描条件 GF254薄层硅胶板(20 cm×10 cm)，条状点样，点样量为2 μL，试验前置110 ℃电热恒温鼓风干燥箱中活化30 min后，在干燥环境中放冷，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸∶水=17∶7∶3∶2上层溶液为展开剂上行展开80 mm，双槽展开缸展开，取出，晾干，以1%AlCl3显色，于365 nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显示出相同颜色的亮黄色斑点(图1)。对木犀草素、芹菜素、金合欢素对照品斑点及供试品中相应的斑点在365 nm波长下进行直线扫描检测，狭缝宽度为6.0 mm×0.3 mm，如图2～3，测量供试品吸光度积分值和对照品吸光度积分值并计算。

A.木犀草素 B.金合欢素 C.芹菜素7～8 混合标准品,1～6,9～14均为滁菊样品

图2 供试品溶液薄层色谱3D展开图

1.木犀草素 2.金合欢素 3.芹菜素

2 结果与分析

2.1 线性关系

使用半自动点样仪分别吸取木犀草素、金合欢素和芹菜素对照品溶液，以点样量1、2、3、4、5、6 μL分别点于GF254薄层硅胶板上，进行展开，成像，扫描。以对照品点样量X(μg)为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明：木犀草、芹菜素、金合欢素在进样量范围内，点样量与峰面积积分值有良好的线性关系(表1)。

表1 标准曲线

2.2 同板的精密度试验

精密吸取木犀草素、芹菜素、金合欢素混合对照品溶液，交叉点于薄层板上各点6个条带，每条带1 μL，按上述薄层色谱条件展开后扫描，测定木犀草素、芹菜素、金合欢素峰面积积分值的RSD 分别为1.40%、1.57%、1.59%;表明该方法精密度良好。

2.3 异板的精密度试验

精密吸取木犀草素、芹菜素、金合欢素混合对照品溶液，交叉点于不同的薄层板上各点6个条带，每条带2 μL，按上述薄层色谱条件展开后扫描，测定木犀草素、芹菜素、金合欢素峰面积积分值的RSD分别为1.45%、1.58%、1.60%;表明该方法精密度良好。

2.4 稳定性试验

在同一 GF254薄层硅胶板上交叉点对照品溶液1、2、3 μL，供试品溶液1 μL，按色谱条件及扫描条件对对照品进行测定，每隔30 min扫描一次，峰面积积分值在2.5 h内基本保持不变，RSD分别为1.23%、1.07%、1.50%，表明2.5 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验

按1.2.1节下的方法配制相同浓度的供试品溶液6份，分别测定木犀草素、芹菜素、金合欢素的含量，结果表明木犀草素、芹菜素、金合欢素峰面积积分值的RSD分别为1.81%、1.67%、1.69%;表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验

精密吸取已知含量的供试品溶液3份200 μL，各加入对照品200 μL，混合均匀。分别吸取上述混合液2 μL点于同一GF254薄层硅胶板上，按色谱条件及扫描条件对样品进行测定，计算回收率和RSD，结果测定木犀草素、芹菜素、金合欢素的平均回收率为99.9%、100.6%、101.3%，RSD分别为1.55%、1.41%、1.64%,表明该方法回收率良好(表2)。

表2 加样回收率试验结果

2.7 样品含量测定试验

取6批样品按1.2.1节方法配制成6份供试品溶液。精密吸取供试品溶液2 μL、混合对照品溶液2 μL和4 μL,分别交叉点于同一硅胶GF254薄层板上，按薄层层析及薄层扫描条件分别测定木犀草素、芹菜素、金合欢素的含量(表3)。

表3 薄层扫描法测定木犀草素、芹菜素、金合欢素的结果

3 结论与讨论

药用植物中成分较为复杂，对其质量差异性不能简单采用单一成分进行判定，应采用多成分进行综合评价[17]。在2015版《中国药典》中对菊花进行定量分析中对单一成分进行了定量分析[2]，该方法并不能完全体现滁菊质量差异性，因此可以采用多成分进行综合定量分析，才能真实体现其质量的差异性[17]。本试验建立滁菊3种主要成分HTLCS分析方法，同时对其进行定量分析，并进行综合评价，在对其质量评价方面更全面，具有实用性，体现滁菊质量差异性，为保障滁菊的安全应用提供依据。

薄层扫描法具有分离效能高、快速、简便等特点，同时薄层板上色斑点稳定性较差且易受其他因素影响，如薄层板的均匀度,板间差异,点样量的准确与否以及显色剂的喷雾均匀度及环境温度等[16]；而HPLCS法操作简单,精确度高，重现性好。HTLCS法具有分离分析双重功能，对样品的预处理要求不高，可以在同一块硅胶板上点样多个样品，能够同时展开分析，展开剂可以根据分离效果进行调配，选择范围宽且用量少，更换方便[16]。目前随着该方法仪器自动化程度的提高，检测的灵敏度、精密度与准确度均有较大的提升，在食品药品分析检测中逐渐成为重要的分析方法。