红叶石楠离体快繁体系的建立

钱晶晶， 周玉丽， 吴 燕， 江文林， 张香杨， 张远兵*

(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.润林建设有限公司，安徽 滁州 239000)

红叶石楠(PhotiniafraseriDress)是蔷薇科石楠属植物，分布广泛[1]。因其新稍为亮红色，具有较高的观赏价值，所以经常作为园林植物应用于道路绿化、园区美化等方面[2]。该树耐盐碱性及耐旱能力较强，适合在土壤贫瘠的地区种植，生长速度快及管理方法简单，在我省极具推广价值和前景[3-4]。但目前红叶石楠的繁殖主要依靠扦插，这种方法受到土地、环境和气候等外界因素制约较多，导致其繁育较慢[5-6]，尤其是占用土地资源较多，也影响农业生产用地。另外扦插繁殖所带来的品种退化，植物寿命短等问题也越来越凸显，因而发展一种现代繁育技术培育红叶石楠种苗，成为目前的当务之急。组织培养可以通过植物的一部分组织或细胞成功的“克隆”出一个完整的植物，也可以缩短植物的繁殖周期。组织培养环境是一个相对封闭、统一的人工环境[7-9]。避免了外界的光、水、养分和菌落的差异，统一了植物的培养环境，避免外界干扰，有利于培养高质量的红叶石楠无性繁殖苗，提高红叶石楠种苗的质量。

本试验通过组织培养的方法，获得可以移栽的红叶石楠离体快繁苗，从而建立红叶石楠的快速繁殖体系，以解决其扦插繁殖品种退化以及受季节、土地限制等问题，为红叶石楠的现代化大规模繁育优质种苗提供参考。

1 材料方法

1.1 供试材料

外植体来源于安徽科技学院种植基地，采集健壮的无病虫害红叶石楠新生嫩茎，去除叶片作为外植体，用流水冲洗10 min，采用赤霉素浸泡30 min后备用。

培养室培养条件：光照为2 400 LX，温度为25±1 ℃，光照时间为12 h/d，相对湿度为60%。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 取红叶石楠茎尖(红叶石楠尖端1 cm嫩芽)，清水冲洗10 min，再放入70%乙醇浸泡30 s，放入超净工作台中，用无菌水冲洗3次，分别用消毒剂进行消毒处理(消毒剂及处理时间见表1)，再用无菌水冲洗5次，最后将冲洗好的材料放于滤纸上备用。

1.2.2 外植体接种 在解剖镜下，用解剖针将外植体茎尖苞片逐层拨开，直到只剩下叶原基生长点，直径约为0.3～0.5 mm。用手术刀切下生长点接种于培养基中，于培养室中培养。35 d后统计污染状况和成活状况。污染率=(污染植株/接种数)×100%，成活率=(成活数/未污染数)×100%。比较不同消毒剂及消毒时处理对红叶石楠茎尖生长的影响，每个处理进行3组平行试验，每组10 颗植株进行试验，记录数据,并计算平均数。

表1 不同消毒剂及消毒时间

1.2.3 不定芽分化及生根培养 接种45 d当成活外植体长到0.5 cm左右时取出，接种到培养基中，培养35 d，统计不定芽诱导率和生长状况，分化率=(分化不定芽数/接种数)×100%，生根=(生根组培苗数/接种数)×100%。试验采取三因素五水平正交设计，比较不同激素及浓度处理对红叶石楠组培苗分化及生根的影响，共25组(表2)。

试验中，以不加激素处理为对照。每个处理进行3组平行试验，每组10颗植株进行试验，记录数据计算平均数。

表2 不同激素及浓度处理组合

1.2.4 炼苗 将生根健壮的组培苗打开组培瓶盖，进行炼苗5 d。炼苗室环境为温度25±1 ℃，光照时间 12 h/d，相对湿度60%～65%。统计成活=(成活数/总炼苗数)×100%。比较不同光照强度(1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 LX)对红叶石楠炼苗成活率影响。每个光照强度为一个处理，每个处理100颗植株，记录数据。

1.2.5 移栽 炼苗后，挑选健壮幼苗洗净根部培养基，移栽到基质育苗盘中，放置于温室中，光照为自然光照，每日早晚于叶片上喷水，保持叶面及土壤湿润，每隔两周喷施稀释10倍MS工作液。30 d后比较不同湿度(50%、60%、70%、80%、90%)对红叶石楠移栽苗成活率影响。每个梯度湿度为一个处理，每个处理50颗植株，记录数据。

1.3 数据统计

本试验采用Excel 2010进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂及消毒时间对红叶石楠茎尖接种的影响

红叶石楠茎尖接种后，5～7 d内开始返青。接种15 d能看到明显的芽点分化，45 d时茎尖完全分化为红叶石楠组培苗，此时苗高达到0.5 cm以上即可以进行后续试验(图1)。

图1 红叶石楠生长离体快繁接种后生长状态

从表3可以看出，5% NaClO消毒20 min以上和HgCl2的消毒8 min以上时污染率明显低于其他处理污染率，可降至16.7%甚至更低。但是NaClO处理过后的红叶石楠茎尖明显出现褐化的现象。HgCl2处理时间超过8 min，虽然没有出现褐化现象，但是茎尖活力明显降低，接种35 d后茎尖返青率从8 min的76.7%迅速降到消毒14 min的46.7%。因此，在外植体的最佳消毒方案为0.1% HgCl2消毒8 min。

表3 不同消毒剂及消毒时间对红叶石楠茎尖接种的影响

2.2 不同激素及浓度组合对红叶石楠不定芽分化的影响

从表4可以看出，第11、16、23组诱导不定芽分化效果较好。激素组合中显示：6-BA对红叶石楠组培苗不定芽起到较好诱导作用，当6-BA浓度高于1.0 mg/L诱导出不定芽也较多，但是当6-BA浓度过高达到2.0 mg/L时，诱导出的不定芽茎细，叶片小，继代后出现死亡现象(第23组)。在试验过程中还发现，KT的存在对诱导出不定芽分化有较为明显的促进作用，KT高于0.4 mg/L时诱导出的不定芽较为粗壮，更适合继代、不定芽分化及生根等。

因而最适合红叶石楠不定芽分化培养基为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT，使用该培养基对红叶石楠组培苗进行培养时，分化率能够达到100%，每株组培苗可以诱导出分化不定芽7.1±1.08 棵，分化出的不定芽平均高度为1.99±0.153 cm，较为健壮适合后续培养(图2A)。

图2 不同激素处理下红叶石楠生长状况

表4 不同激素及浓度组合对红叶石楠组培苗生长的影响

2.3 不同激素及浓度组合对红叶石楠组培苗生根的影响

本试验红叶石楠最优生根培养基为第19组：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.9 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。该条件下培养35 d后诱导生根率可达到100%，培养每棵组培苗平均生根数为14.9±2.42，根红褐色、粗壮，平均根长8.47±0.959 cm。苗高5.36±0.148 cm，茎粗，非常适合移栽(图2B)。值得注意的是，对照组(第1组)在各个激素为零的情况下，也出现了部分组培苗生根情况，说明该植株较易生根，添加NAA浓度为0.3 mg/L时就出现红叶组培苗在分生不定芽的同时有70.0%±0.10%的组培苗诱导生根的现象(第17组)。但是红叶石楠组培苗生根水平并不是随着NAA的生根而持续升高，在NAA浓度为1.2 mg/L时(第10组和第25组)，其生根率和生根数都出现了下降趋势。因而，本试验中红叶石楠生根培养中NAA最适添加浓度为0.9 mg/L。

2.4 炼苗移栽

选取粗壮的红叶石楠组培苗进行炼苗及移栽试验。炼苗中，光照强度直接影响到组培苗的存活率，在光照强度低的情况下炼苗5 d，红叶石楠组培苗存活率最高，光照强度达到2 000 LX时，红叶石楠组培苗成活率明显降低仅为45%，且移栽过程中未出现明显差异。

表5 不同光照条件下炼苗5 d红叶石楠组培苗存活率

空气湿度时影响红叶石楠组培苗移栽成活率的重要因素，表6显示，在移栽温室空气湿度为70%，移栽成活率可达99%，是最为理想的移栽条件。移栽30 d后的红叶石楠叶片生长加快、茎节短、腋芽开始萌发、根部逐渐变黑、生长明显、长势佳(图3C)，符合工厂化育苗要求。

表6 不同空气湿度条件下红叶石楠移栽成活率

3 结论与讨论

本试验从消毒剂种类、激素添加量等对红叶石楠组织培养过程进行筛选：(1)外植体的最佳消毒方案为：0.1% HgCl2消毒8 min；(2)不定芽分化最佳培养基为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT；(3)红叶石楠最优生根培养基为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.9 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。避免了近年来关于红叶石楠的组织培养研究中研究不系统等[10-13]问题。其次，关于红叶石楠组织培养的研究生中，并未明确炼苗和移栽的研究条件及成活率，使规模化育苗的成本难以统计，不具备生产价值[14]。本试验从炼苗和移栽主要条件进行筛选出移栽苗最大成活率，试验显示1 000 LX强度下炼苗5 d后。放置于温室中，光照为自然光照，每日早晚于叶片上喷水，保持叶面及土壤湿润，每隔两周喷施稀释10倍MS工作液，在空气湿度70%的条件下，移栽苗成活率达到99%，适合红叶石楠大规模工业生产。多数研究文章选取腋芽或茎段作为外植体，使得外植体取样时间多在早春中进行，范围较为窄小[15]。另外，本试验采取红叶石楠茎尖作为材料进行外植体接种，由于红叶石楠自身生长特性，使接种时间扩大到4至11月份，随时取样、随时接种，扩展了接种时间。最后，本试验通过茎尖剥离的方法对红叶石楠进行离体快繁处理，使红叶石楠苗更加健壮，解决了传统扦插繁殖红叶石楠品种退化、植株老株病株多等问题。