昆虫病原线虫P01与白僵菌Bbn6对烟田蛴螬的联合作用

余佳敏，孔垂旭，肖 勇，余祥文，白梦娇，王 蓉，张海华

(1.中国烟草总公司四川省公司，四川 成都 610041；2.云南绿叶生防科技有限公司，云南 玉溪 653100)

【研究意义】蛴螬(White grubs)是鞘翅目(Coleoptera)金龟子总科(Scarabaeoedea)幼虫的统称，是地下害虫中造成植物损失最大的一大重要类群(Chen et al.，2008)，其食谱广泛，涉及植物涵盖烤烟、大豆、花生、小麦、马铃薯、蔬菜、中药材、苗圃、果树、草坪等[2]。蛴螬取食烟株根部，常造成缺苗、断垄或幼苗生长不良[3]，据相关统计，烟株移栽期因蛴螬取食造成烟苗死亡率达5 %～20 %，近年来，随着烟田有机肥的增施，农田林网化的加速发展，蛴螬生境越发适宜，使得蛴螬的发生与为害呈现出逐年加重的趋势[4]，严重影响了烤烟的正常生产及烟农种烟的积极性[3]，因此防治工作已迫在眉睫。目前，防治蛴螬效果较好的化学农药有：辛硫磷、甲基异柳磷、丁硫克百威、吡虫啉、毒死蜱、敌百虫[5]，但由于蛴螬生境较为隐蔽，在一定范围内具逃避化学药剂的能力[1]，化学药剂常常出现防效差且不稳定的现象，此外，长期使用化学农药，还会带来药物残留高、抗药性增加、土壤理化性质恶化、环境污染等一系列负面问题[2, 6]。生物防治“以菌治虫，以虫治虫”的策略，不仅具有选择性高、安全性好、对生态系统影响小、不易产生抗药性等诸多优点，而且天敌昆虫还有主动搜寻害虫的特性，在一定程度上能避免害虫对化学药剂的躲避[1]，因此生物防治备受关注。【前人研究进展】目前，用于蛴螬生防领域的防控因子主要有：昆虫病原细菌、昆虫病原真菌、昆虫病原线虫等。昆虫病原细菌中应用最为广泛的是苏云金芽孢杆菌(Bt)，如2000年冯书亮等[7]研究发现Bt HBF-1菌株对褐异丽金龟1～2龄幼虫的毒杀作用，14 d时致死率达100 %，2008年刘兴龙等[8]研究发现1株对暗黑齿爪鳃金龟、琉璃弧丽金龟、柳叶跳甲等幼虫具有杀虫活性的菌株B-DLL，并对其晶体蛋白基因进行了克隆，取得了显著的防治效果，并正式命名为cry8Ea2；生产中防治蛴螬应用较多的昆虫病原真菌是白僵菌和绿僵菌，如安徽省农业技术推广总站曾利用2 %白僵菌粉制剂防治花生蛴螬，防效可达65.4 %～69.2 %，增产率在15 %以上[9]，又如陈正州等[10]将球孢白僵菌与麦麸进行复配用于防治田间花生蛴螬，防效超过了70 %；谢宁、申剑飞和殷幼平等筛选出蛴螬高致病力金龟子绿僵菌菌株CQMa128、CQM132和CQM135，其中CQMa128已生产出微粒剂和乳粉剂等剂型，可有效控制田间蛴螬对花生的危害[11]。蛴螬是昆虫病原线虫首次应用于害虫防治的靶标，也是昆虫病原线虫应用研究最为广泛的地下害虫[12]，如许艳丽等[13]对H.bacteriophoraNJ线虫进行了温室盆栽试验，结果发现H.bacteriophoraNJ线虫剂量为5 IJs /cm2、连续施用2～3次可对东北大黑鳃金龟幼虫进行，防治效果高达71.4 %。虽然上述3种蛴螬生防因子的研究应用都取得了显著的成效，但在应用过程中均具有一些局限性，如①BT毒力不强、杀虫谱窄、持效期和货架期短、害虫产生抗性等[14]；②土壤抑菌作用会严重影响昆虫病原真菌对蛴螬的防治效果[15]；③同种昆虫病原线虫对不同蛴螬种类的敏感度的差异较大，单独施用效果常常不稳定[12]。因此需要综合考虑各生防因子的利弊，将各生防因子进行有机结合，才能显著提高防治效果。【本研究切入点】本研究将前期筛选的对蛴螬具有较高活性的白僵菌Bbn6菌株与昆虫病原线虫P01线虫联合使用来防治烟草蛴螬进行室内测试及田间应用验证，进一步探索2种生防因子间的协同增效机制。【拟解决的关键问题】为烟草蛴螬生物防治提供理论依据与实践指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试线虫：Pellioditisspp. P01(以下简称为P01)，2015年于攀枝花仁和区大龙潭彝族乡干坝子村板栗树的根际土壤诱集得到。供试昆虫：暗黑鳃金龟幼虫，2017年于攀枝花仁和区干坝子村烟田采集的暗黑鳃金龟幼虫经室内饲养获得；大蜡螟幼虫，购于成都张氏虫业，10 ℃保存备用。供试菌株：白僵菌(Beauverbassiana)Bbn6(以下简称为Bbn6)，2017年于攀枝花仁和区干坝子村采集的烟田感病金针虫分离纯化得到，保存于云南绿叶生防科技有限公司。供试培养基：PDA培养基、改良查氏液体培养基，用于Bbn6的活化及发酵液的制备，配置方法参照文献[16]。供试设备：RXZ-160A-LED 型人工气候培养箱，购于宁波江南仪器厂；FCD-211XF型冰箱，购于青岛海尔特种电冰柜有限公司。供试作物：烤烟‘云烟87’，由四川省烟草公司攀枝花市公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 P01线虫悬浮液的制备 采用滤纸侵染法培养P01线虫，即：在放有双层灭菌滤纸的6 cm塑料培养皿中接入5头大蜡螟末龄幼虫，按100 IJs/头大蜡螟的接种量接入P01侵染期线虫，25 ℃下侵染48 h，待大蜡螟死亡后，将其放于线虫收集皿上，5 d后逐日收集线虫悬浮液，用无菌水配置成100、200、400 IJs/mL的线虫悬浮液，4 ℃保存备用。

1.2.2 暗黑鳃金龟幼虫的饲养 饲养方法参照文献[2]，略有改动。采集暗黑鳃金龟成虫带回室内用塑料餐盒饲养。塑料餐盒底铺一层过40目筛的厚度约为5 cm、湿度15 %左右的灭菌细砂，放入适量幼嫩的烟叶作饲料，并盖上用绣花针打有10个小孔的盖子。待成虫交配产卵后将卵转移至到装有灭菌细砂的培养皿中(湿度为15 %左右)，在 25 ℃左右的人工气候箱中统一孵化，幼虫在装有15 %湿度灭菌细砂的塑料餐盒中饲养，每盒5头，以0.5 cm3大小的马铃薯切块饲养至1龄期保存备用，为保证湿度以及充足的饲料，每隔2周对细砂和马铃薯进行一次更换。

1.2.3 Bbn6发酵液的制备 制备方法参照文献[17]，略有改动。在无菌条件下向直径6 cm灭菌的PDA平板培养基上接入1 cm×1 cm 白僵菌Bbn6菌块，接种完成后转至25 ℃的恒温箱中进行暗培养7 d后，待Bbn6长满整个平板，用直径5 mm的打孔器打2 个菌饼转接至50 mL 已灭菌改良查氏液体培养基的三角瓶内，于25 ℃、150 r/min摇床振荡培养7 d(此时孢子浓度约为108CFU/mL)，置于 4 ℃ 冰箱中保存备用。

1.2.4 不同剂量P01线虫对蛴螬1龄幼虫致病力的室内测试 采用土壤处理法测试P01线虫对蛴螬1龄幼虫的毒力，测试方法参考文献[2]、[18]，略有改动，试验在温度为 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工气候培养箱(RXZ-160A-LED)中进行(光周期24 h，Day∶Night=6∶18)。在普通塑料餐盒中平铺入5 cm 厚的灭菌细砂(含水量约15 %)和一定量的0.5 cm3大小的马铃薯切块，将蛴螬的1龄幼虫分别放入盒中，每盒加入5头体型一致且健康的蛴螬1龄幼虫作为一个处理，然后分别滴加不同浓度梯度(100、200、400 IJs/mL)的线虫悬浮液5 mL，以滴加等量灭菌水的处理作为对照，每处理3平行，每24 h 检查蛴螬的死亡情况，检查至12 h，记录死亡率并计算校正死亡率。

1.2.5 Bbn6发酵液对蛴螬1龄幼虫毒力的室内测试 采用细砂处理法对虫体进行接菌，测试方法参考文献[19]，将上述1.2.3的10 mL(相当于田间每穴的用量)Bbn6发酵液拌厚度5 cm的灭菌细砂并转移至塑料餐盒内。每餐盒接入10头蛴螬作为1个处理，每处理3次重复，以嫩烟叶作为饲料饲养，以无菌水为空白对照。处理完成后转移至温度为 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工气候培养箱(RXZ-160A-LED)中，每3 d观察1次，计算累计死亡率和校正累计死亡率。

1.2.6 Bbn6对P01线虫致病力的室内测试 测试方法参考文献[17]，取灭菌60 mm的玻璃培养皿，加入2 mL的无菌水及1 mL 200 IJS/mL的线虫悬浮液，然后加入1 mL 108 CFU/mL Bbn6发酵液，对照用3 mL无菌去离子水及1 mL的悬浮液200 IJS/mL的线虫悬浮液，轻轻摇动使其充分混匀，每处理3 次重复，放置于25 ℃的恒温培养箱，分别于 24、48 h 镜检并记录供试线虫总数和死亡数， 并计算线虫死亡率和校正死亡率。

线虫死亡率=死亡线虫数/供试线虫数 × 100 %。

校正死亡率=(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)× 100 % 。

1.2.7 P01与Bbn6防治蛴螬联合作用的室内测试 将10 mLBbn6发酵液拌厚度5 cm的细砂，搅拌均匀后移至塑料餐盒内，滴加10 mL P01侵染期3龄幼虫(400 IJS/mL)，每餐盒接入10头蛴螬作为1个处理，每处理3次重复，以嫩烟叶作为饲料饲养，并设P01、Bbn6单用处理，以无菌水处理为空白对照。处理完成后转移至温度为 25 ℃、RH 80 %的RXZ型人工气候培养箱(RXZ-160A-LED)中，每24 h观察1次，计算累计死亡率和校正累计死亡率。

1.2.8 P01与Bbn6防治蛴螬联合作用的田间测试 试验于2017年5-9月在攀枝花仁和区大龙潭彝族乡干坝子村起德洪家烟田进行，往年蛴螬发生较严重，采用起垄覆膜的栽培模式，5月12日移栽，株行距：0.5 m×1.2 m。试验设4个处理，处理P01：单独施用P01线虫，用量为4000条/穴；处理Bbn6：单独施用Bbn6发酵液，用量为10 mL/穴；处理P01+Bbn6：同时施用P01线虫与Bbn6发酵液，用量同于T1、T2；处理CK：空白对照。每处理3次重复，共12个小区，每小区植烟90株。于烤烟打顶期(7月12日)调查各处理的烤烟主要农艺性状，调查方法同于文献[19]，烟叶采收结束(9月12日)，采用 5 点取样法，每点调查 5株，共25株，记载蛴螬(活体)头数，计算虫口减退率，计算公式如下。

虫口减退率( %)= (对照区虫数-处理区虫数)×100/对照区虫数。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2007进行数据统计，DPS7.0软件进行显著性检验，Duncan氏新复极差法进行多重比较[19]。

2 结果与分析

2.1 P01线虫对蛴螬1龄幼虫的致病力

3种浓度的P01线虫对暗黑鳃金龟1龄幼虫的致病力结果详见图1。随着线虫侵染寄主时间的延长及线虫剂量的增加，暗黑鳃金龟1龄幼的校正死亡率呈逐步增长的趋势，72 h前以400 IJS/mL的增强趋势最明显，校正死亡率达86.67 %，且96、120 h时400 IJS/mL浓度的P01线虫对暗黑鳃金龟1龄幼的校正死亡率均达100 %。说明P01线虫对暗黑鳃金龟1龄幼虫的最适致死浓度为400 IJS/mL。

图1 不同浓度的P01线虫对蛴螬1龄幼虫的致病力Fig.1 Pathogenicity of different concentrations of P01 nematodes to white grubs in the first instar larvae

图2 不同浓度的Bbn6发酵液对蛴螬1龄幼虫的致病力Fig.2 Pathogenicity of different concentrations of Bbn6 fermented liquid to white grubs in the first instar larvae

2.2 Bbn6发酵液对蛴螬1龄幼虫毒力的室内测试

3种浓度的Bbn6发酵液对暗黑鳃金龟1龄幼虫的致病力结果详见图2。随着时间的延长及Bbn6发酵液浓度的增加，暗黑鳃金龟1龄幼的校正死亡率呈逐步增长的趋势，处理后的3～15 d，1×108CFU/mL的Bbn6发酵液对暗黑鳃金龟1龄幼虫的校正死亡率均高于1×107、1×106CFU/mL的Bbn6发酵液，说明Bbn6发酵液对暗黑鳃金龟1龄幼的最佳致死浓度为1×108CFU/mL。

2.3 Bbn6对P01线虫致病力的室内测试

如表1所示。24～120 h，Bbn6发酵液对P01线虫的校正死亡率在0.33 %～4.71 %之间，且与改良查氏液体培养基对照的校正死亡率无明显差异，说明Bbn6对P01线虫的毒力较小。

2.4 P01与Bbn6防治蛴螬的联合作用

400 IJS/mL P01线虫与1×108CFU/mL Bbn6发酵液防治蛴螬的联合作用的室内测试结果详见图3。处理后24～96 h，随着时间的延长，各处理对暗黑鳃金龟1龄幼虫的校正死亡率呈逐渐增长的趋势，72 h前以处理P01、处理P01+Bbn6的增长趋势较明显，24、48、72 h P01+Bbn6对暗黑鳃金龟1龄幼的校正死亡率为36.67 %、63.33 %、96.67 %，且显著高于P01单独处理及Bbn6单独处理，处理96 h后P01+Bbn6对暗黑鳃金龟1龄幼的校正死亡率达100 %。

图3 P01与Bbn6防治蛴螬的联合作用的室内测试Fig.3 Laboratory test on combination effect of P01 and Bbn6

P01线虫与白僵菌Bbn6联合防治烟草蛴螬田间试验结果详见表2。施药后61 d，P01+Bbn6混合处理的株高与P01单用处理、Bbn6单用处理之间差异不显著；在茎围、最大叶长、最大叶宽方面，均以P01+Bbn6混合处理最好，P01单用处理、Bbn6单用处理之间差异不显著。药后123 d，虫口数最高的为CK处理216.7头/cm3，虫口数最低的为处理P01+Bbn6 56.0头/m3，P01单用处理、Bbn6单用处理的虫口数分别为109.3、118头/m3。虫口减退率以P01+Bbn6混合处理最高为73.69 %，其次为P01单用处理，虫口减退率为49.19 %，最低的为Bbn6单用处理，虫口减退率为45.05 %。

表1 Bbn6对P01线虫致病力

注：同列数据后不同大、小写字母分别表示不同处理在0.01、0.05水平差异显著，下同。

Note：The different lowercase letters within the same column indicate significant difference (P<0.05), different capitals mean extremely significant difference (P<0.01); The same as below.

表2 P01线虫与白僵菌Bbn6协同作用防治烟草蛴螬

综上所述，P01线虫与白僵菌Bbn6在防治烟草蛴螬中具有明显的协同增效作用，P01线虫与白僵菌Bbn6混合使用，既能显著改善烤烟的农艺性状，又能显著降低烟草蛴螬的为害。

3 讨 论

不同白僵菌菌株的发酵液对昆虫病原线虫的毒力存在差异，如陈立杰等[20]研究了20 株白僵菌发酵液对小杆线虫的生物活性，发现大多白僵菌菌株对小杆线虫均具有较高的致死率，只有B51、B701085菌株对小杆线虫的毒性较小，本研究发现，白僵菌Bbn6发酵液对小杆线虫P01的毒力较小，24～120 h的校正死亡率在0.33 %～4.71 %，这可是因为本研究中Bbn6与B51、B701085菌株在遗传方面存在高度相似性，但这一假设还需要对Bbn6与B51、B701085的DNA序列进行比对进一步确定。

400 IJS/mL P01线虫对暗黑鳃金龟1龄幼96 h校正致死率达100 %，而田间防治效果仅为49.19 %，这可能与施用方法或线虫的使用剂量较少有关，因为昆虫病原线虫对湿度比较敏感，过于干燥会对线虫产生不利的影响[21]，本实验中采取是先施线虫后浇水的方法，相关研究结果证实，采取先浇地后再施线虫的方法能提高昆虫病原线虫的防治效果[22-23]，在田间应用中，一般说来，随着使用剂量的加大，线虫对寄主昆虫的寄生能力随之提高[24-26]，因此可否通过增加小杆线虫P01的用量来提高烟草蛴螬的防治效果，还需要大量的试验进行验证。

田间试验结果表明，P01线虫与白僵菌Bbn6联合使用烟草蛴螬的防治效果高达73.69 %，显著高于P01线虫单用处理、白僵菌Bbn6单用处理，这与国外联合利用绿僵菌与小杆线虫防治草地蛴螬之间存在协同增效作用的结果相一致[27]，这为田间利用昆虫病原线虫与地下害虫生防真菌混用防治烟草蛴螬的可行性提供了科学依据，但两者之间的协同增效机制还需要大量的研究进行探索。

4 结 论

研究结果表明，白僵菌Bbn6发酵液对P01线虫的毒力较小，无论在室内还是大田，白僵菌Bbn6与P01混合使用防治蛴螬的防治效果均显著高于P01单用和Bbn6单用，因此昆虫病原线虫P01与白僵菌Bbn6之间存在显著的协同增效作用，为田间利用昆虫病原线虫与地下害虫生防真菌混用防治烟草蛴螬的可行性提供科学依据。