转2mG2-epsps基因耐草甘膦玉米T抗-4对非靶标除草剂的耐受性评价

余桂容，宋 军，陈 谦，张 维，徐利远, 杜文平*

(1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)

【研究意义】随着全球人口的不断增多，人类对粮食作物需求也日益增多，传统的农作物遗传育种已无法完全满足人类日益增长的需求，转基因工程技术的出现为农作物育种提供了全新的广阔前景[1]。【前人研究进展】根据国际农业生物技术应用服务组织报道，转基因作物至1996年商业化种植以来，在全球范围内取得迅速发展。截至2017年，全球转基因作物种植面积达到1.898亿公顷[2]。转基因技术自诞生以来，生物安全问题相伴而生。在转基因作物的研究和产业化过程中，转基因作物的安全性是最受关注也是必须要保证的关键问题[3]。随着第二代转基因作物的商业化，外源基因和转基因作物种类的增加，其安全性引发了越来越激烈的争论[4]，由于转基因作物会产生抗性而导致超级杂草、基因漂移的可能性等说法会引发环境安全，更加提高了公众对转基因作物及产品安全性的担忧，并在许多国家成为转基因作物推广的强大阻力。有关转基因作物的争论主要集中在以下几点：转基因作物的食品安全性、环境安全性、标记基因安全性及长期生态效应[5-6]。按国际惯例，转基因生物安全性主要分为环境安全性与食用安全性评价。在环境安全上，研发人在关注法律法规要求的安全性测试数据的同时，还应针对生产实践中可预见的影响转基因玉米可持续利用的潜在问题制定科学的解决预案[7]。如何科学地评估转基因作物的安全性， 并将风险评估和风险管理给公众清晰明确、值得信任的答案，是科学界和政策决策者所要深思的问题[8]。由于长期种植耐除草剂和抗虫转基因作物所带来的高度选择压力，靶标生物的抗性问题也越来越引起人们的重视[9]。因此，研究转基因作物对非靶标除草剂的耐受性，不能让转基因作物成为人们担心的那样产生靶标除草剂的抗性后成为超级杂草，减少和消除公众对转基因作物安全性的担忧，这是转基因作物环境安全评价的重要内容。迄今，关于耐除草剂性状转基因玉米对非靶标除草剂耐性的报道甚少。【本研究切入点】本项目在明确T抗-4耐受靶标除草剂草甘膦功能有效性的基础上，开展转化体T抗-4综合农艺性状评价以及对非靶标除草剂的耐受性评价试验。结合农业生产实践，本项目选取常规玉米田间普遍施用的除草剂、常规玉米敏感的除草剂以及非选择性、灭生性除草剂。【拟解决的关键问题】作为非靶标除草剂的研究对象，以期为全面评价玉米转化体T抗-4的环境安全提供基础试验数据。

1 材料与方法

1.1 玉米材料

转2mG2-epsps基因耐除草剂草甘膦玉米T抗-4及其对应的非转基因玉米材料18599按照农业部中间试验批文号农基安办报告字2018第358号批复于2018年4月20日至2018年8月30日种植于四川省农科院植物高新技术育种示范园。2mG2-epsps抗除草剂草甘膦基因来源于中国农业科学院生物技术研究所从土壤微生物中克隆的自主专利基因[10]，玉米T抗-4是四川省农业科学院生物技术核技术研究所用西南骨干玉米自交系18599作为受体亲本转导2mG2-epsps基因获得的高效表达材料。

1.2 非靶标除草剂

1.2.1 适用玉米除草剂 烟嘧磺隆：普通饲用玉米常用的苗后除草剂。本项目使用的烟嘧磺隆的商品名为“玉公孙”(生产商，山东奥坤)，剂型为10%的可分散油悬浮剂，每667 m2按有效成分133.3 mg/L喷施30 L(图1A)。硝磺草酮-莠去津：玉米田常用的广谱性复配除草剂。本项目使用的混剂的商品名为“玉律”(生产商，德州祥龙)，剂型为25 %的可分散油悬浮剂，每667 m2按有效成分833.3 mg/L喷施30 L(图1B)。

1.2.2 玉米敏感除草剂 精喹禾灵：适用作物包括大豆、油菜、阔叶蔬菜等多种作物及果树、林业苗圃等。玉米对精喹禾灵敏感，误施或邻近地块施药，雾滴飘移到玉米植株上都会产生药害。本项目使用的精喹禾灵的商品名为“风华精锐”(生产商，山东丰泽)，剂型为10 %的乳油，每667 m2按有效成分166.7 mg/L喷施30 L(图1C)。

1.2.3 灭生性除草剂 草铵膦：属于非选择性、触杀型除草剂。本项目使用的草铵膦的商品名为“隔日乐”(生产商，河北国美)，有效成分草铵膦的含量为10 %，剂型为可溶液剂。每667 m2按有效成分1666.7 mg/L喷施30 L(图1D)。

1.3 试验方法

1.3.1 综合农艺性状评价 参照《NY/T 1209-2006：农作物品种试验计数规程玉米》。农艺性状调查指标包括：播期、出苗期、成苗率、抽雄期、吐丝期、散粉期、完熟期、株高、穗位、叶片数、花丝颜色、花药颜色、株型等。室内考种调查指标包括：穗长、穗粗、秃尖长度、秃尖率、穗行数、行粒数、穗粒数、百粒重等。采用3次重复试验设计，小区面积100 m2，最终换算667 m2产量。

1.3.2 对非靶标除草剂的耐受性评价 ①试验设计：3次重复，5 m行长，1行区，行距60 cm，株距25 cm，不同重复之间有1 m的过道。小区面积为3 m2(5 m × 0.6 m )。常规栽培管理。小区设计示意图(图2)。在转基因玉米和对照材料长至三叶一心至五叶一心时喷施除草剂，喷施浓度分别为田间推荐剂量中量的1和2倍以及不喷施除草剂的清水对照。选压力稳定带扇形喷头的喷雾器进行施药，保证使药剂均匀分布到整个小区，所用器械类型为三燕牌背负式电动喷雾器(型号：3WBD-16)，工作压力为0.15～0.4 MPa，不锈钢四喷头，长度70 cm，喷施高度50 cm(图3)。②试验处理：转基因玉米不喷施除草剂； 转基因玉米喷施非靶标除草剂；对应的非转基因玉米不喷施除草剂；对应的非转基因玉米喷施非靶标除草剂。③数据调查：分别在用药后1、2和4周调查和记录成苗率、植株高度(选取最高的5株)、药害症状(选取药害症状最轻的5株)。药害症状分级按GB/T 19780.42执行。a.如果药害能被计数或测量，则用绝对数值表示，例如植株数(喷药株数、死亡株数)或植株高度(选取最高的5株)。b.用药1周后，根据药害症状，给每个处理药害定级(表1)。除草剂受害率按公式(1)计算。

“0×、1×、2×”表示喷施除草剂中剂量的0、1、2倍图2 非靶标除草剂耐性有效性评价小区设计Fig.2 Plot design for evaluation of tolerance effectiveness of non-target herbicides

左为背负式电动喷雾器，右为四联扇形喷头图3 试验用喷施器械 Fig.3 Spraying apparatus for the test

表1 药害级别及其症状

表2 T抗-4田间物候期性状调查

注：同列数据采用LSD法检验差异显著性(α=0.05)。

Note: LSD method was used to test the significance of the same column of data (α= 0.05).

表3 T抗-4田间表型性状调查

注：同列数据采用LSD法检验差异显著性(α=0.05)。

Note: LSD method was used to test the significance of the same column of data(α=0.05).

(1)

式中：X——受害率，单位为百分率( %)；N——同级受害株数；S——级别数；T——总株数；M——最高级别。

除草剂喷施时间为2018年5月11日。在喷施除草剂溶液1周(18/5)，2周(25/5)和4周(7/6)后，观察不同材料和喷施浓度处理的田间表现、调查药害情况和株高。

2 结果与分析

2.1 玉米转化体T抗-4综合农艺性状

在无除草剂处理条件下，田间物候期性状T抗-4成苗率为(85.0±2.0) %，与对照18599无显著差异(84.0 ±2.0) %(P> 0.05)，二者出苗期均为(16.0±0 ) d；T抗-4的抽雄期、散粉期和吐丝期分别为(78.0±0 )、(81.0±0 ) 和(83.0±0) d，均显著短于对照18599(P< 0.05)，但二者完熟期相差不足1 d，且无显著差异(P> 0.05，表2)。

田间表型性状T抗-4具有白色根、紫红色芽鞘、紫红色花药、红色花丝、披散株型，这些性状与对照18599相同；T抗-4在完熟期共有(14.5±0.0) 个叶片，18599有(15.1±0.2) 个叶片，二者无显著差异(P>0.05)；T抗-4株高为(154.6±1.5) cm，与18599株高无显著差异(P>0.05)；穗位方面，T抗-4为(46.7±2.2) cm，18599为(58.4±1.5) cm，二者差异也不显著(P>0.05，表3)。

产量性状方面，T抗-4具有锥型穗、硬粒型、黄粒色和白色轴，这些都与18599一致。T抗-4和18599在穗长、突尖、穗粗、穗行数、行粒数、百粒重和产量方面均无显著差异(P> 0.05)，但T抗-4轴重显著低于对照18599(P< 0.05)，二者分别为 (19.9±0.2) 和(30.2±0.5) g(表4)。

以上数据表明，转化体T抗-4与转化受体18599相比，在主要农艺性状表现上基本无差异。

2.2 玉米转化体T抗-4对非靶标除草剂的耐受性

2.2.1 非靶标除草剂喷施1周后的田间表现 喷施1和2倍推荐中剂量的非选择性、灭生性除草剂草铵膦1周后，转化体T抗-4及其非转基因对照18599，以及田间杂草均100 %干枯、死亡(图4A)。说明在农业生产中，耐草甘膦性状的转基因玉米T抗-4可以通过常规的玉米敏感除草剂和非选择性除草剂草铵膦进行防治和杀灭，保障了转化体的环境安全。

表4 T抗-4产量及考种性状调查

注：同列数据采用LSD法检验差异显著性(α=0.05)。

Note： LSD method was used to test the significance of the same column of data (α=0.05).

喷施1 和2倍推荐中剂量的玉米敏感除草剂精喹禾灵1周后，转化体T抗-4及其非转基因对照18599均表现严重的药害症状，药害等级为4～5级，药害率为100 %(图4B)；但对田间杂草——空心莲子草没有影响。说明玉米敏感的除草剂，部分杂草不一定敏感。

喷施1和2倍推荐中剂量的玉米常用除草剂硝磺草酮-莠去津混剂和烟嘧磺隆1周后，转基因玉米T抗-4和非转基因对照18599均生长正常，无药害，与清水对照一致，但杂草开始枯黄(图4C、图4D)。

2.2.2 非靶标除草剂喷施2周后的田间表现 喷施1和2倍推荐中剂量的非选择性、灭生性除草剂草铵膦2周后，转化体T抗-4及其非转基因对照18599，以及田间杂草均100 %干枯、死亡(图5A)。喷施1和2倍推荐中剂量的玉米敏感除草剂精喹禾灵2周后，转化体及其非转基因对照18599均100 %死亡(图5B)；但对田间杂草——空心莲子草影响不大。喷施1和2倍推荐中剂量的玉米常用除草剂硝磺草酮-莠去津混剂和烟嘧磺隆2周后，转基因玉米T抗-4和非转基因对照18599均生长正常，无药害，与清水对照一致，但杂草开始枯死(图5C、图5D)。说明玉米常用除草剂硝磺草酮-莠去津混剂和烟嘧磺隆是较好玉米地的选择性除草剂。

2.2.3 非靶标除草剂喷施4周后的田间表现 非靶标除草剂喷施4周后的整体田间表现见图6A。喷施1 和2倍推荐中剂量的非选择性、灭生性除草剂草铵膦4周后，转化体T抗-4及其非转基因对照18599，以及田间杂草均100 %干枯、死亡(图6B)。

喷施1和2倍推荐中剂量的玉米敏感除草剂精喹禾灵4周后，转化体及其非转基因对照18599均100 %死亡(图6C)；但对田间杂草——空心莲子草影响不大，其余杂草死亡。

A：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施草铵膦1周；B：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施精喹禾灵1周；C：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施硝磺草酮-莠去津1周；D：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施烟嘧磺隆1周图4 非靶标除草剂喷施1周后的田间表现Fig.4 Field performance after 1 week of non-target herbicide application

A：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施草铵膦2周；B：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施精喹禾灵2周；C：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施硝磺草酮-莠去津2周；D：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施烟嘧磺隆2周图5 非靶标除草剂喷施2周后的田间表现Fig.5 Field performance after 2 week of non-target herbicide application

A：非靶标除草剂试验的整体田间表现；B：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施1和2倍草铵膦4周；C：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施1和2倍精喹禾灵4周；D：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施1倍硝磺草酮-莠去津4周；E：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施2倍硝磺草酮-莠去津4周；F：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施1倍烟嘧磺隆4周；G：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施2倍烟嘧磺隆4周；H：转化体T抗-4和非转基因对照18599喷施清水4周后的田间表现图6 非靶标除草剂喷施4周后的田间表现Fig.6 Field performance after 4 week of non-target herbicide application

喷施1和2倍推荐中剂量的玉米常用除草剂硝磺草酮-莠去津混剂和烟嘧磺隆4周后，转基因玉米T抗-4和非转基因对照18599均生长正常，无药害，与清水对照一致，但杂草完全枯死(图6D-G)。说明玉米常用除草剂硝磺草酮-莠去津混剂和烟嘧磺隆是较好玉米地的选择性除草剂，且使用1倍的浓度就可以了。

喷施清水作为对照处理表明：转基因玉米T抗-4和非转基因对照18599均生长正常，但杂草也正常生长(图6H)。

2.2.4 不同非靶标除草剂不同喷施浓度对株高的影响 为了更细致的评价2种玉米常用除草剂对转化体和受体对照生长的影响，对各处理下的玉米株高进行了调查，如表5所示，在0，1和2倍处理1周后，2周后和4周后，转化体T抗-4及其非转基因对照18599的株高无显著差异；不同浓度处理之间的株高也无显著差异。说明适用玉米除草剂并未抑制植株的正常生长。转化体和非转基因对照除了在目标性状草甘膦抗性方面具有显著差异之外，对非靶标除草剂莠去津和烟嘧磺隆的耐性表现具有等同性。

表5 T抗-4和18599在不同非靶标除草剂喷施浓度条件下的株高

续表5 Continued table 5

材料Materials除草剂及浓度Herbicides and concentrations调查时间Investigation time株高(cm)Plant heightP 值P value185991×莠去津喷施后2周47.4±1.7 a185992×莠去津喷施后2周44.1±1.2 aT抗-41×烟嘧磺隆喷施后2周54.7±8.6 a0.25T抗-42×烟嘧磺隆喷施后2周55.5±9.2 a185991×烟嘧磺隆喷施后2周45.5±5.2 a185992×烟嘧磺隆喷施后2周46.1±4.7 aT抗-41×莠去津喷施后4周112.5±9.6 a0.31T抗-42×莠去津喷施后4周112.3±10.8 a185991×莠去津喷施后4周105.2±6.1 a185992×莠去津喷施后4周100.5±6.5 aT抗-41×烟嘧磺隆喷施后4周114.5±15.2 a0.40T抗-42×烟嘧磺隆喷施后4周111.3±14.6 a185991×烟嘧磺隆喷施后4周96.8±9.4 a185992×烟嘧磺隆喷施后4周102.0±13.9 a

注：数值以3次生物学重复的平均值±标准差表示，同列小写字母相同表示相同地点相同材料不同喷施剂量之间经LSD法检验差异不显著(P> 0.05)。

Note: The values were expressed by the mean ± standard deviation of three biological repeats, and the same small letters in the same column indicated that the difference between different spraying doses of the same material in the same place was not significant by LSD (P> 0.05).

3 结论与讨论

我国把食物安全、生态安全、绿色发展等作为重大需求，对产业发展有带动作用的目标性状突出、综合性状优良的新型转基因动植物品系是当前重点研发导向。随着转基因技术的不断发展，尤其是基因RNA干扰技术、合成生物学、编辑技术等生物育种新技术的出现，正是转基因作物安全评价进一步发展和完善的良好时机。转基因作物的安全评价为转基因新品种产业化提供科学支撑。

目前，草甘膦抗性的杂草和Bt蛋白抗性的害虫已有报道[11-12]。本试验分别选取常规玉米田间普遍施用的除草剂(硝磺草酮-莠去津和烟嘧磺隆)、常规玉米敏感的选择性除草剂(精喹禾灵)以及非选择性除草剂(草铵膦)，作为非靶标除草剂的研究对象，通过人工喷施1和2倍的田间推荐剂量，评价转化体对非靶标除草剂的耐受性。结果表明：上述非靶标除草剂对受体植株18599和玉米转化体T抗-4的影响是一致的。这一方面说明，转化体和受体对照虽然对靶标除草剂草甘膦的耐受性方面存在显著差异，但是对非靶标除草剂的耐性表现具有等同性；另一方面说明，未来的商业化生产过程中，耐草甘膦性状的转基因玉米T抗-4可以通过常规的玉米敏感除草剂和非选择性除草剂草铵膦进行防治和杀灭，转基因玉米田也可应用常规玉米田除草剂进行除草，这为转基因玉米的人工控制、自生苗防除以及抗性杂草出现后的杂草治理提供了可用的措施，进一步保证了转化体的环境安全性。转化体T抗-4的综合农艺性状评价表明在植物形态学上表现上与转化受体18599基本无差异，为进一步评价转化体的生存竞争能力提供基础资料。

转基因玉米作为生物技术产业化重大成果，已在世界各地普遍应用，不远的将来，转基因玉米在我国的产业化应用也将是大势所趋，为此，应在技术上尤其是安全评价方面做好充分的准备。将进一步完成高抗草甘膦转基因玉米T抗-4环境安全性评价的其他部分试验以及食用性安全评价等。