不同温度对三年生三七各部位皂苷含量的影响

2019-04-26周润泽王翊豪周玉厚朱灵英郑国伟马晓惠季鹏章徐福荣

西南农业学报 2019年12期

周润泽，王翊豪，周玉厚，朱灵英，郑国伟，马晓惠，季鹏章，徐福荣

(云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500)

【研究意义】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]为五加科人参属植物，使用其根和根茎供临床使用[1]。主产地为中国云南、广西等省(区)，云南文山是三七的道地产区，文山州的低纬高原生态环境是形成文山三七道地性的决定因素[2]。自古以来三七被普遍应用在多种方剂中，如复方丹参丸、地奥心血康、云南白药等。近年来，三七除应用在医药行业外，也被广泛用于化妆品和保健品，每年对三七的需求量达到8000 t[3]。当前文山州三七种植面积和产量占全国的98 %，受三七连作障碍的影响，目前三七面临着无地可种的难题，逐渐从海拔1200～2000 m的地区向更高海拔、高纬度的低温地区引种，造成其种植带逐渐向以冬春季极端低温和易持续低温天气为主的北方转移[4-6]。提高三七的皂苷含量和三七无地可种所造成的种植带转移是现阶段所面临的主要问题。【前人研究进展】三七对温度、光照、湿度、土壤等生态因子十分敏感，生态适应性差，研究表明环境对三七的生长发育及皂苷积累有重要影响[7]。生长/分化平衡(Growth/differentiation balance，GDB)假说、最佳防御(Optimun defense，OD)假说和资源获得(Resource availability，RA)假说中均表明当植物处于环境胁迫时，其自身次生代谢产物会增加[8-9]。次生代谢产物是中药中的主要成分，皂苷是三七主要的次生代谢产物，含量约占三七块根的10 %～12 %[10-11]。温度可影响药用植物的光合作用、呼吸作用等生理功能，造成植物体内的有效成分的形成和积累[12]。Oh[13]和刘佳[14]等研究显示低温胁迫可显著增加人参中的总皂苷含量。【本研究切入点】随着生物医药和大健康产业的快速发展，三七的需求量迅猛增加，导致当前三七种植地逐渐向非道地产区外移，然而，有关不同温度对三七植株不同部位皂苷积累的影响鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究针对即将采收的3年生三七，采用人工气候，设置不同温度梯度培养30 d，分别对三七的主根、剪口、茎和叶4个部位进行皂苷含量分析，预期阐明不同温度对三七不同部位皂苷含量的影响，为三七引种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2018年8月12日采自文山州砚山县三七种植基地，选取生长正常、长势一致的3年生三七(Panaxnotoginseng)。对照品为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd(HPLC ≥98 %，北京索莱宝科技有限公司)；甲醇(色谱纯，SIGMA，USA)；HPLC(型号Agilent1260Ⅱ，USA)。

1.2 实验方法

将盆栽的3年生三七分别置于10、15和20 ℃人工气候室内培养30 d，每个处理6株。同时，在基地选取12株生长基本一致的三七作为对照，其中6株于9月12日采收，作为人工气候室温度处理的对照材料(CK)，另外6株11月12日采收(采收期组)，用于比较不同采收期三七的皂苷含量。

将不同温度处理后的3年生三七，以及生长在基地的3年生三七各6株，去泥洗净。将清洗后三七的主根、剪口、茎和叶4个部分分别置于烘箱内，在40 ℃下将样品烘干至恒重并研磨成粉，保存备用。

称取主根、剪口、茎和叶粉末各0.1 g，置于试管内，用甲醇进行溶解，超声振荡提取1 h，静置10 min后，用0.45 μm有机滤膜过滤，所得滤液为供试品。

将对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd混合，加甲醇定容到10 mL。

利用高效液相色谱法进行检测，并参照2015版药典有关三七质量检测的方法[15]。根据对照品溶液浓度的标准曲线计算提取液的浓度。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同温度对三七主根中皂苷含量的影响

从表1可知，三七皂苷R1等4种皂苷成分，只有人参皂苷Rg1在不同温度处理间差异显著，以20 ℃含量为最高，依次为20 ℃(4.4380 %)> 10 ℃(4.3500 %)> 15 ℃(3.3721 %)> CK(3.0762 %)。三七皂苷R1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd各处理间均未呈显著差异。其中，三七皂苷R1以15 ℃最高，为1.1356 %；人参皂苷Rb1以20 ℃最高，为3.6175 %；人参皂苷Rd以20 ℃最高，为1.1098 %。三七总皂苷含量亦以20 ℃最高，且20 ℃与15 ℃和10 ℃呈显著差异，20 ℃与CK呈极显著差异，其含量依次为20 ℃(10.1506 %)> 10 ℃(9.2027 %)> 15 ℃(8.4686 %)> CK(7.5603 %)。综上表明，20 ℃有利于主根中皂苷含量的积累，其差异主要来源于主根中的人参皂苷Rg1含量差异。

表1 不同温度下3年生三七主根中皂苷含量

注：同一行数据后不同小写字母表示0.05水平上，下同。

Note: Data following by small letters in the same line meant significant difference at 0.05 level.The same as below.

表2 不同温度下3年生三七剪口中皂苷含量

2.2 不同温度对三七剪口中皂苷含量的影响

从表2可知，剪口中三七皂苷R1等4种皂苷含量在不同温度处理间均未呈显著差异。三七皂苷R1以15 ℃最高，为1.9046 %；人参皂苷Rg1以20 ℃最高，为6.7542 %；人参皂苷Rb1以15 ℃最高，为4.7827 %；人参皂苷Rd以15 ℃最高，为1.7422 %。剪口中三七总皂苷含量在不同温度下差异不显著，以15 ℃最高，为14.2905 %。

2.3 不同温度对三七茎中皂苷含量的影响

从表3可知，茎中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量极低，通过HPLC并未检测出。人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd在不同温度处理间均未呈现显著差异；人参皂苷Rb1以CK最高，为0.2895 %；人参皂苷Rd以CK最高，为0.1340 %。茎中三七皂苷亦未呈现显著差异，其含量为0.4235 %。综上表明，三七茎中皂苷含量在不同温度下差异不显著，以CK的皂苷含量为最高。

2.4 不同温度对三七叶中皂苷含量的影响

从表4可知，叶中三七皂苷R1通过HPLC未检出，同时CK组叶中未检出人参皂苷Rg1。叶中人参皂苷Rb1存在显著差异，以15 ℃含量最高，20 ℃最低，依次为15 ℃(0.2510 %)>CK(0.2470 %)>10 ℃(01939 %)>20 ℃(0.1199 %)；人参皂苷Rd亦存在显著差异，以CK含量最高，20 ℃为最低，依次为CK(0.0430 %)>15 ℃(0.0350 %)>10 ℃(0.0321 %)>20 ℃(0.0169 %)；人参皂苷Rg1未呈显著差异，以15 ℃下含量最高，为0.1573 %；三七总皂苷含量以15 ℃为最高，与CK和10 ℃差异不显著，与20 ℃差异显著，依次为15 ℃(0.4433 %)>10 ℃(0.3243 %)>CK(0.2900 %)>20 ℃(0.1957 %)。综上表明，15 ℃有利于叶中皂苷的积累，其差异主要来源于主根中的人参皂苷Rg1含量差异。

表3 不同温度下3年生三七茎中皂苷的含量

表4 不同温度下3年生三七叶中皂苷的含量

图1 采收期与对照组三七主根总皂苷含量分析Fig.1 Content analysis of total saponins in main root of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

2.5 不同采收时期三七主根及剪口中皂苷含量分析

从图1可知，三七皂苷R1：采收期(1.1901 %)> CK(0.9616 %)，高出23.76 %；人参皂苷Rg1：采收期(3.9943 %)> CK(3.0762 %)，高出29.85 %；人参皂苷Rb1：CK(2.6583 %)> 采收期(2.3375 %)，高出13.72 %；人参皂苷Rd：CK(0.8642 %)> 采收期(0.7579 %)，高出14.03 %；总皂苷：采收期(8.2798 %)> CK(7.5603 %)，高出9.52 %。

从图2可知，三七皂苷R1：采收期(1.9022 %)> CK(1.8720 %)，高出1.61 %；人参皂苷Rg1：采收期(6.9168 %)> CK(4.9553 %)，高出39.58 %；人参皂苷Rb1：CK(4.4511 %)> 采收期(3.7765 %)，高出17.86 %；人参皂苷Rd：CK(1.5352 %)>采收期(1.5129 %)，高出1.47 %；总皂苷：采收(14.1085 %)> CK(12.8136 %)，高出10.11 %。

三七皂苷R1与人参皂苷Rg1含量呈现增长趋势，人参皂苷Rb1与人参皂苷Rd含量呈现降低趋势，但三七总皂苷含量依然是采收期高于提早采收的CK组。因此，三七需适时采收，不宜提早采收。

3 讨论

本研究选取同一产地的3年生三七，对不同温度处理下的三七主根、剪口、茎和叶的三七皂苷含量积累情况进行分析。结果表明，不同温度下的三七主根和叶中的皂苷含量存在差异，但剪口和茎对温度不敏感。

图2 采收期与对照组三七剪口总皂苷含量分析Fig.2 Content analysis of total saponins in rhizome of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

研究发现，4个处理温度下，三七主根三七总皂苷含量以20 ℃时最高，15和10 ℃三七总皂苷含量也均高于对照组。剪口中的三七总皂苷含量以15 ℃时最高，20和10 ℃时，其所含三七总皂苷也均高于对照组。这与黄璐琦[16]提出的中药材逆境效应相呼应，一定的低温有利于三七地下部分三七总皂苷的积累。在4个温度下，均呈现人参皂苷Rg1>人参皂苷Rb1>三七皂苷R1，与朱洁[17]等研究结果和分析一致。同时，20和10 ℃的主根和剪口均为三七皂苷R1>人参皂苷Rd。综上，一定的低温可促进三七总皂苷的积累，但不同的温度对不同的皂苷积累仍存在差异。

研究发现，4个处理温度下，3年生三七的茎中测定到的成分为人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd，刘英等[18]研究三七的地上部分主要以20(S)-原人参皂苷二醇型为主与此结果相一致。实验中测得4种皂苷以人参皂苷Rb1含量最高，白敏等[19]研究也有此结论。三七茎与三七主根皂苷的主要区别在于三七茎中主要含有人参二醇型皂苷[20]。通过分析对照组茎中三七总皂苷高于低温处理的，这表明低温会减缓三七茎的生长。

4个温度处理，15 ℃时三七叶中所含三七总皂苷含量最高，20 ℃时最低。在15 ℃其叶中所含三七皂苷含量高，或与低温可诱导叶中花色苷合成有关[21]，低温不仅可诱导花色苷的合成，并可增加叶中皂苷含量。叶中三七总皂苷以人参皂苷Rb1较多，并测得人参皂苷Rg1和人参皂苷Rd。朱洁[17、22]等，利用HPLC-UV测定三七叶，检测到人参皂苷Rb3、Rc、Rb1和Rd，与本研究中测得人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd相符。

采收期的三七皂苷总含量高于对照，采收期与对照的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的总量分别为采收期(8.18 %)>对照(7.59 %)，均高于2015年版《中华人民共和国药典》中要求的5 %[15]。崔秀明等[23]研究发现，采收期的三七主根与剪口皂苷含量均高于非采收期的三七，与本研究所得结论相一致。