云南地方有色米种质资源多样性及Rc基因的遗传变异分析

李 霞，杜 娟，杨晓梦，普晓英，杨加珍，曾亚文

(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】云南是中国稻种最大的遗传多样性中心和亚洲栽培稻籼粳分化中心[1]，其中有色米资源十分丰富，几乎占云南地方稻种资源的一半[2]。有色稻米种皮富含天然色素，具有很强的抗氧化性和自由基清除功能，在抗癌、抗炎症、抗菌、保护视力、预防心血管疾病和糖尿病等方面都具有重要生理功能[3-5]。目前针对水稻种质资源多样性研究报道较多[6-8]，但对有色米遗传多样性的研究确相对薄弱，因此，对云南有色米种质这一宝贵资源的开发与利用，对中国功能稻米育种发展将起到积极的推动作用，同时也将有效促进云南地方特色健康产业的快速发展。【前人研究进展】国外学者对红米种皮颜色基因的研究发现，该基因位点位于第7染色体，隐性白米种皮无着色是源于Rc基因第6外显子的14 bp的缺失区段，缺失导致该基因失去功能[9]。国内学者通过对长雄野生稻、红宝石及红米品种培杂191的种皮颜色基因定位也得到相似的结论，初步定位结果均显示种皮颜色基因位于第7染色体上，红白米之间Rc基因存在类似的缺失变异[10-12]。【本研究切入点】以来自云南省23个州、县的35份地方水稻种质资源为研究对象，利用分子标记技术对其进行遗传多样性分析；同时探究已报道的Rc基因在上述35份种质材料中的遗传变异。【拟解决的关键问题】作为云南地方稻种资源的代表，有色米有着重要的社会及经济价值，对云南地区有色米的遗传多样性分析及相关功能基因的鉴定，将实现有色米在分子水平上的分类，有效解决有色米资源鉴定的精度及准确度问题，对有色米资源的保护及利用提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所功能食品作物课题组，收集并筛选出来自23个州、县具有代表性的云南地方种质资源35份，其中包括23份红米地方种质资源和2份黑米种质资源(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 田间取幼嫩叶片，CTAB小样法提取基因组总DNA，紫外分光光度计检测DNA质量及浓度，稀释到50 ng/μl备用。

1.2.2 PCR体系 引物：本实验所选用的的24对水稻SSR引物均匀分布于12条染色体上，来自于http://www.gramene.org，由昆明硕擎有限公司合成。PCR反应体系总体积为10 μl：2×TsingKe Master Mix 5 μl，50 ng/μl DNA模板1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，最后以2.5 μl ddH2O补平。2×TsingKe Master Mix 购买自昆明硕擎有限公司。 PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，64～55 ℃(touch-down PCR)退火30 s，72 ℃下延伸30 s，10个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃ 延伸5 min。扩增产物用8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色后置于白炽灯箱上照相、记录。

1.2.3 数据分析 根据每个SSR标记在参试各品种相同迁移率位置上(以DNA Marker作为标准)显示条带的有无记录，有带记为1，无带赋值0，建立1，0型二元矩阵。计算材料间遗传相似系数(GS)参照Nei和Li的方法[13]，公式：GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni为材料i中出现的扩增片段数目，Nj为材料j中出现的扩增片段数目，Nij为材料i和j共有的扩增片段数目。利用GS值按不加权成对群算术平均法(UPGMA)和SHAN程序进行遗传相似性聚类分析。利用NTSYS-pc2.1[14]软件生成树状聚类图。

表1 各品种名称及米色性状调查

续表1 Continued table 1

编号Number品种名称Variety name原产地Origin籼/粳Indica/Japonica 米色Rice color15五里香广南县粳红米16黄壳糯保山市粳白米17旱扬谷罗平县粳白米18小硬糯新平县粳黑米19乌嘴谷凤庆县粳白米20长毛背子谷墨江县粳红米21西洋谷富宁县粳红米22大花糯墨江县粳红米23灰谷腾冲市粳红米24红吊糯石屏县籼黑米25毫毫孟连县籼红米26老鼠牙江川县籼红米27灰皮紫糯版纳州籼红米28冷水谷墨江县籼红米29南高谷临沧市籼红米30小白糯云 县籼红米31大墨谷墨江县籼红米32冷水香屏边县籼红米33马田谷大关县籼红米34细白谷临沧市籼红米35红米寒窝电景洪市籼红米

2 结果与分析

2.1 SSR引物的多态性

24对SSR引物均能得到清晰且重复性好的条带，在35份亲本材料中共检测到78个等位变异，其中单个引物可扩增出1～6个等位变异，平均每个引物可检测到2.2个等位变异。引物RM3513和RM6356均能检测到6个等位变异(表2)。

表2 SSR标记信息

图1 云南地方有色米种质资源多样性聚类分析Fig.1 Cluster analysis of diversity of local colored rice germplasm in Yunnan province

2.2 遗传相似系数(GS)与聚类分析结果

根据SSR标记计算亲本间遗传相似系数，其变幅为0.59～0.97，平均值为0.78，结果如图1所见。来自新平县的地方有色米种质资源小硬糯与来自凤庆县的白米地方种质资源乌嘴谷遗传相似系数最高，为0.97，表明二者亲缘关系最近；其次为孟连县的红米种质毫毫与新平县的白米种质小矮脚糯(0.9348)。在35份地方种质中新平县的小矮脚糯与耿马县的木邦谷间的遗传相似系数最低，为0.57，表明二者亲缘关系最远；而同为新平县的地方种质小矮脚糯与小硬糯并未表现出较高的遗传相似性，遗传相似系数仅为0.84。在GS值为0.59处，35份材料可分为2大类，基本上是以粳稻和籼稻为主要区分归类标准。在GS值为0.69处，第一亚类又可以分为2组，第1组有14份材料，第2组有2份材料；第二亚类在此处也可以分为2组，第1组有22份材料，第2组有1份材料。从两大亚类所包含的材料遗传多样性来看，粳稻组所包含的材料遗传相似系数主要集中在0.78～0.88，而籼稻组材料间遗传相似系数主要集中在0.88～0.97，这表明在云南地方品种中粳稻间的遗传多样性较籼稻更丰富。总体来看云南地方种质资源中，同一来源地的地方品种遗传差异较大，究其原因与云南地区特有的复杂地理及气候条件有较大关系。

2.3 Rc基因在25份有色米材料中的遗传变异

利用已报道的水稻红米种皮颜色基因Rc序列，针对第6外显子内的14 bp的缺失差异区段设计功能特异引物：GXL：5’-TGAAGGAAGTGATGACAACAAGACC-3’，GXR5’-ATGGTTGGCACTGAAATCACCTTGG-3’，对25份有色米资源进行标记检测,结果表明， 35份云南地方水稻资源中，红米Rc基因表现为野生型，白米Rc基因表现为突变型，且突变类型与已报道的突变位点一致，均表现为第6外显子内的14 bp的缺失，这与前人报道结果相似。同时2份黑米材料Rc基因也发生了类似的缺失突变(图2)，这与梁婷婷[15]的报道类似，再次说明黑米和红米呈色物质应由不同的代谢途径产生。

3 讨 论

3.1 云南地方有色稻米的遗传多样性

水稻是世界一半人口的主要粮食，种植历史悠久，稻种资源极为丰富。随着人们生活水平的提高，功能型水稻也越来越受到重视[16]，其中有色米作为代表之一，在中国地方水稻资源中有着多样类型及广泛分布。就种皮的颜色而言，可分为紫黑米、红米、黄米和绿米，其中以紫黑米和红米最常见。有色米主要分布在云贵高原和华南一带，其中以云南、广西、湖南、贵州省居多[17-18]。云南地方稻种资源中有色米资源十分丰富，几乎占云南地方稻种资源的一半，其中51.23 %是籼稻，48.77 %的是粳稻，集中分布在滇南单、双季籼稻区域[19-20]。通过对35份云南地方种质(其中25份为有色米资源)的遗传多样性分析发现，基本上是以粳稻和籼稻为主要划分标准。从两大亚类所包含的材料遗传多样性来看，粳稻组材料遗传相似系数主要集中在0.78～0.88，而籼稻组材料间遗传相似系数主要集中在0.88～0.97，这表明云南地方品种粳稻间的遗传多样性较籼稻地方种更丰富。总体来看云南地方种质资源，同一来源地的地方品种遗传差异较大，究其原因与云南地区特有的复杂地理及气候条件有较大关系。

图2 红米白米及黑米的Rc基因第六外显子的序列差异Fig.2 Sequence differences in the sixth exon of Rc in red rice, white rice and black rice

3.2 水稻红米Rc基因在云南地方水稻种质资源中的遗传变异

随着生物技术的不断进步，对有色稻米的研究转入更深层次的分子水平，即有色米种皮颜色基因的定位与克隆。国外学者研究发现红米种皮颜色基因位点位于第7染色体，隐性白米种皮无着色是源于Rc基因第6外显子内的14 bp缺失，缺失导致框架改变而使该基因失去功能[9]。国内学者通过对长雄野生稻、红宝石及红米品种培杂191的种皮颜色基因定位也得到相似的结论，初步定位种皮颜色基因位于第7染色体上，红白米之间Rc基因存在类似的缺失变异[10-12]。对35份云南地方水稻资源中Rc基因变异检测结果表明，红米Rc基因表现为野生型，白米Rc基因表现为突变型，且突变类型与已报道的突变位点一致，均表现为第6外显子内的14 bp缺失。同时2份黑米材料Rc基因也发生了类似的缺失突变，这与梁婷婷[15]结果一致。通过对不同来源的白米、红米及紫黑米品种Ra及Rc位点的基因型鉴定。红米品种为raraRcRc型，黑米品种为RaRarcrc型，而白米品种则为rararcrc型。这说明不同颜色的有色米，花青素物质的积累可能通过调控不同的结构基因来实现。由于分子标记辅助选育已在水稻育种中广泛应用[21]，以上Rc基因的变异信息将为云南有色米的分子标记育种提供依据，

4 结 论

在云南地方品种中粳稻间的遗传多样性较籼稻地方种更丰富。总体来看云南地方种质资源，同一来源地的地方品种遗传差异较大，究其原因与云南地区特有的复杂地理及气候条件有较大关系。35份云南地方水稻资源中，红米Rc基因表现为野生型，白米rc基因表现为突变型，且突变类型与已报道的突变位点一致，均表现为第6外显子内的14 bp的缺失。云南地方品种中粳稻间的遗传多样性较籼稻地方种更丰富。总体来看，云南地方种质资源中同一来源地的地方品种遗传差异较大。