光谱技术在食源性致病菌检测中的应用

王 成，陆雨菲，刘 箐

（1．上海理工大学 医疗器械与食品学院 生物医学光学与视光学研究所，上海 200093；2．上海理工大学 医疗器械与食品学院 系统生物医学研究中心，上海 200093）

引 言

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等食源性致病菌[1], 对食品安全构成了严重的威胁。在美国每年由于食源性致病菌造成的损失高达数百亿美元[2]。我国2016年第二季度食品安全抽检结果表明[3]，约四分之一的食品存在严重的食源性致病菌污染问题。随着经济全球化的发展，食源性致病菌的中毒事件呈现出更广泛的爆发形势。因此，建立快速检测食源性致病菌的新技术已经成为控制和维护食品安全的关键。

目前对食品微生物的主流检测方法仍以生化培养分析法为主[4-8]，对致病菌的检测过程所需平均时间为1～2天。面对生长较为缓慢的致病菌(如分枝杆菌)时，分析过程可能需要几周时间才能完成。常规检测方法通过取样、培养、分析、对比等手段来获得参数结果，存在操作繁琐、耗时较多等弊端。目前微生物检测的“金标准”仍是常规的生化鉴定法[9-12]。免疫学检测技术已经较为成熟，但如何克服灵敏度和特异性之间的矛盾从而实现精准的定量分析，是免疫学检测法长期需要攻克的问题[13]。利用生物芯片进行检测鉴定具有实效性，但成本太高，难以普及[14]。为了迎合食品安全检测的迫切需求，适用于食源性致病菌现场检测的技术需要具备重现性好、便携快捷等性能。

光谱中负载着特定的分子信息，近几十年来一直被用于检测和识别生物物质。光谱分析技术可脱离实验室环境，降低检测成本，避免环境污染，实现快速、精确的在线监测。在减少微生物培养时间的同时，可提高检测鉴定效率[15-16]。这种具有非侵入性和非破坏性特点的检测方法在食源性检测领域具有良好的前景。

1 光谱技术在食源性致病菌检测领域的应用

1.1 红外光谱技术

红外吸收光谱是一种用于物质分子研究的分子振动光谱[17]，依据红外吸收光谱的峰位、峰强和峰形可以识别菌体细胞[18]。2017年，Wang等[19]用同步加速器红外显微光谱仪采集了单核增生性李斯特菌等6种常见食源性致病菌的光谱，如图1所示。研究表明3 000～2 800 cm−1，1 800～1 500 cm−1和 1 200～900 cm−1波长区域分别代表脂质、蛋白质和多糖，根据这三个波段内的差异可以对细菌进行鉴别。与传统的红外光谱技术相比，此方法只需几微升的细菌悬浮液就能在几分钟内在种和亚种水平对食源性致病菌加以区分，更加高效便捷。

现有研究表明，将红外光谱和计量统计学相关方法结合，可以有效识别常见食源性致病菌。此方法需要突破的核心问题是实际应用场合中存在的噪声和大量干扰因素，在光谱分析与建模过程中要开发具有高抗扰能力的数据处理方法。混合溶液是食品安全卫生领域常见的物质形态，其光谱具有复杂的干扰因素，对其在线监测有一定的影响，因此还需要进一步的研究探索。

图1 典型致病菌的红外光谱[19]Fig. 1 The infrared spectra of typical pathogens[19]

1.2 近红外光谱技术

近红外(NIR)光谱承载的信息主要包括分子化学键振动的倍频与组频信息。当用近红外光照射样品时，近红外光谱中承载着分子转动和振动的特征信息[20]。在细菌检测方面，研究者将近红外光谱技术和数理统计学分析方法结合，取得了较为满意的识别结果[21]。2017年，Zhang等[22]建立了一种近红外免疫层析技术，使用其所建立的近红外免疫法对副溶血弧菌进行了检测，在45 min内检测限达到1.2×102CFU/mL，并与其他菌种无交叉识别。此方法适用于复杂样品的快速检测。Xu等[23]将比色度传感器和近红外光谱法结合，分别用比色度传感器和近红外光谱法获得了假单胞菌的气味和光谱信息，从中提取了36种气味因子和33个光谱特征变量，采集的原始光谱及经过标准正态变量(SNV)处理的光谱分别如图2和图3所示。基于主成分分析(PCA)对所提取的数据进行融合，同时利用反向传播人工神经网络建立识别模型，对不同的假单胞菌进行识别，其中5组假单胞菌的PCA结果如图4所示，识别正确率达到98.75%。

图2 原始光谱图[23]Fig. 2 Averaged raw spectra[23]

图3 SNV 处理后的光谱图[23]Fig. 3 Preprocessed spectrum by SNV[23]

图4 5 组假单胞菌的主成分分析结果[23]Fig. 4 PCA classification results for five groups of Pseudomonas spp.[23]

NIR技术结合自动识别算法可以实现食源性致病菌的快速检测。目前多数研究以菌种水平分类为主，关于亚种水平的相关研究还处于起步阶段[24]。此外，近红外光谱本身具有严重的多重共线性，在数据分析过程中应该建立有效的建模算法来消除多重共线性。

1.3 表面增强拉曼光谱技术

表面增强拉曼光谱(SERS)技术是Fleischmann等[25]在1974年的研究中提出的。此后SERS技术便成为光谱领域里最为重要的研究课题。SERS以金属纳米结构介导信号，可实现高达1014倍的单分子拉曼信号增强，可以在保证灵敏度的同时有效降低检测限[26]。同时SERS技术具有灵敏度高、选择性好、获取信号精准度高等优点。2017年，Gao等[27]以金纳米颗粒(AuNP)为纳米颗粒团作为SERS增强基底对金黄色葡萄球菌进行检测，检测限低至1.5 CFU/mL。与现有检测方法相比，此技术可以用于混合样本中原位细菌的快速检测。此方法实用性及灵敏度较高，应用潜力较大。为了进一步提高灵敏度，Pearson等[28]开发了一种基于3-巯基苯磺酸(3-mbpa)的核酸适配子技术，以李斯特菌作为目标菌种，在3-巯基苯磺酸和银纳米颗粒(AgNP)的相互作用下形成了具有选择性的SERS。此方法最低检测限为102 CFU/mL，在降低检测限的同时保证了较高的准确率，不足之处在于前处理过程较为繁琐，同时拉曼基底的稳定性还有待提高。以上这两种方法仍停留在实验室实验阶段，要投入实际应用还需不断探索。为了提高食源性致病菌检测准确性，许多研究者对于混合盲样中检出某种特定菌进行了研究。Chen等[29]以AuNP为SERS基底，用NIR-SERS技术采集饮用水中的大肠杆菌、单核增生性李斯特菌等几种常见食源性致病菌的光谱进行检测，并对两株李斯特菌的光谱进行比较。两株李斯特菌的拉曼光谱及特征峰归一化强度比分别如图5和图6所示。在5 min之内检测到拉曼信号并将两株金黄色葡萄球菌从其它菌株中分离出来。该方法可选择性区分不同的细菌种类，并有潜力用于生物医学和食品安全应用的现场诊断领域。为了进一步提高检测灵敏度，同组成员 Mungroo等[30]以银纳米溶胶作为SERS基底，结合聚类分析和主成分分析两种方法，建立了一套快速检测病菌的便携式系统，结合微流控平台成功地区分了大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌等8种不同的致病菌。该方法可以区分复杂微生物溶液中的特定菌种，同时提供了一个可以快速、实时检出食源性致病菌的平台，并且不需要昂贵的管理费用，市场化前景良好。目前应用高灵敏度的方法和平台对样本进行定量分析仍然具有很大的挑战性。在后续的研究中，SERS技术应该增强复合标签能力，提高生物相容性[31]，以获得复杂样品中灵敏度较高、重现性良好的结果。

图5 2 株李斯特菌的拉曼光谱[29]Fig. 5 Two species of Listeria[29]

图6 2株李斯特菌的特征峰归一化强度比[29]Fig. 6 Normalized intensity ratio of significant peaks from two Listeria spp.[29]

1.4 荧光光谱技术

荧光光谱具有灵敏度和选择性较高、信号重现性好、测量精度较高的优点，多用于定量分析[32]。2017年，Silva等[33]测量了不动杆菌的4种不同基因型的二维荧光光谱，用偏最小二乘法对其进行建模分类，识别准确率高达97.7%。不足之处是需要实验环境温度保持恒温状态，此方法难以适用于现场检测。白冰等[34]将纳米免疫磁珠富集技术和荧光光谱技术相结合，检测金黄色葡萄球菌和福氏志贺氏菌的混合溶液，各浓度目标菌的荧光强度如图7所示，细菌菌落数对数值与目标菌相对荧光强度的线性关系如图8所示。结果表明，此方法在2 h内对福氏志贺氏菌的平均捕获效率高达88.73%。该方法与传统检测方法相比更加高效快捷。目前，研究者多将荧光光谱技术和微流控芯片技术相结合，在如何对检测系统进行优化改进，从而实现自动化、高通量的原位识别分选等方面还存在着极大的研究和发展空间。

图7 对各浓度目标细菌荧光强度的测定[34]Fig. 7 Determination of fluorescence intensity of different concentration of target bacterial pathogens[34]

1.5 小 结

表1分别通过检测限、检测时间、被检菌种等指标列举了上述光谱技术在食源性致病菌检测中的应用。傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术、NIR和SERS技术可以快速获取食源性致病菌的生化指纹。但FTIR技术对水较为敏感，这限制了它在检测领域的应用。SERS可提供与FTIR互补的微生物指纹信息，并且不受水的影响，因此更加适用于检测溶液状态的样品。现有SERS技术虽然已经实现单菌水平的检测，但纳米基底的生物相容性是否良好仍然会严重影响检测结果的重现性。荧光光谱技术多与微流控芯片分析方法结合，已经突破传统致病微生物检测法的部分瓶颈和局限[35]，为了将其推广并应用于食源性致病菌现场检测领域，我们还需要继续完善优化其中的各项实验，以达到产品化的目的。

图8 细菌菌落数的对数值与目标菌的相对荧光强度值的线性关系[34]Fig. 8 Linear relationship between the change in relative fluorescence intensity and the logarithmic value of target bacterial pathogens[34]

表1 光谱分析用于食源性致病菌检测Tab. 1 Spectral technique in the detection of foodborne pathogenic bacteria

2 弹性散射光谱技术在食源性致病菌检测领域的应用

2.1 动态光散射技术

动态光散射(DLS)基于实时监控，通过统计样品中各种散射颗粒的散射光总强度随时间的变化趋势，从而分析颗粒大小、状态等信息。纳米金颗粒在特定的波长会产生强烈的光散射信号，鉴于此特性，Huang等[42]将AuNP和DLS技术结合，构建的DLS分析流程如图9所示。该方法显示出良好的选择性和特异性。在0.01%的磷酸盐悬浮液中，30 min内对李斯特菌的检测极限低至3.5 CFU/mL，在生菜样品中检测限低至22 CFU/g。该方法为混合菌种中检测目标菌种的相关研究提供了新的分析方法和研究平台，在复杂的底物中对目标菌种进行准确检测，可用于快速实时的现场检测。

图9 DLS 分析流程图[36]Fig. 9 Schematic of the proposed DLS assay format[36]

2.2 表面等离子共振光散射技术

表面等离子共振(SPR)技术[43-44]是一种利用反射光谱进行病原菌检测的常见方法。其检测原理是通过测量共振角度的变化检测分子间相互作用。当金属表面的物质或物质量发生变化时，折射率发生变化，表现为共振角的偏移, 共振角会随金属薄膜表面通过的液相折射率的改变而改变, 折射率的变化(RIU)又与结合到金属表面的生物分子质量成正比。SPR能够检测到折光率微小的变化。病原菌的直接标记检测也可以利用此种方法。

1998年 Fratamico等[43]首次使用SPR传感器检测大肠杆菌0157：H7以来，SPR传感器已经成为典型的生物分析工具。目前利用SPR技术的生物传感器可以对单增李斯特菌、沙门氏菌[45]、大肠杆菌O157：H7以及空肠弯曲菌等食源性病原菌进行检测。2016年，Nguyen等[46]利用便携式表面等离子共振技术检测了沙门氏菌，在1 h内检测限达到107～109CFU/mL。尽管检测限不够低，但便携式SPR传感器是可以用于食品安全检测的。未来可以通过提高灵敏度从而降低检测限。Oh等[47]用金纳米颗粒增强便携式SPR生物传感器设备对猪肉表面的鼠伤寒沙门氏菌进行了研究，他们对样品进行实时处理并在注入样品30～35 min后得到了结果，检测流程如图10所示。结果表明，该设备的检测灵敏度为104CFU/mL。这种生物传感器只对沙门氏菌有特异检出效果。一个良好的生物传感器必须具备从复杂的混合物中检测出目标分析物的能力, 即使是在有背景微生物的情况下也能显示出高灵敏度和高选择性。

图10 表面等离子共振芯片传感器检测猪肉中的鼠伤寒沙门氏菌[41]Fig. 10 Detection of S. typhimurium in pork using the aptamer-based localized surface plasmon resonance sensing chip[41]

2.3 其他弹性散射技术

Jo等[48]搭建了基于傅里叶变换光散射(FTLS)的测量系统，结合统计学方法在单菌水平对李斯特菌、大肠杆菌、乳杆菌、枯草芽胞杆菌实现了无标记识别。利用FTLS技术精确地测定了菌体的二维角散射图，并提取了具有指纹特性的图谱。结果表明对盲样的识别率高达94%。该方法在单菌水平实现了无标记检测，有效节约了时间成本，在食源性致病菌快速检测领域具有广泛的适用性。Huffman等[49]利用多波长的角散射光谱技术，分析了6种主要食源性致病菌，其中对金黄色葡萄球菌的灵敏度高达94.6%。该系统可以取代需要革兰氏染色剂的传统金黄色葡萄球菌检测手段，为快速检测金黄色葡萄球菌搭建了一个灵敏度较高的技术平台，同时为其他致病微生物的识别检测开拓了全新的鉴定思路。

2.4 小 结

基于弹性光散射的光学检测方法可以将菌体细胞的空间信息加载在光谱信息中，无需复杂的前处理过程，即可实现在体测量细胞内部结构分布状态。通过对散射光谱进行特征提取，可以对不同的菌体细胞进行分析辨别。相对于非弹性散射检测技术，弹性光散射光谱可以描述不同种类菌体细胞形态及细胞器的光谱特征。该测量方法具有系统简单、重复性好、光谱信号精度高等优点，更有利于便携式检测设备的设计搭建，从而满足现场检测的要求。由于此特性，弹性光散射技术在检测领域的应用逐渐引起研究者们的关注。

3 展 望

通过对食源性致病菌进行识别检测，可以有效阻止恶性食品安全事件的发生。现有的快速检测技术实现单菌水平的定量检测仍有一定困难[50]，且大多停留在实验室阶段，距离产品化的实现还需要更多的研究论证。随着检测技术的发展，针对食源性致病菌的检测方法不断涌现,稳定性不足、灵敏度较低等仍是研究者们需要攻克的主要问题。光谱分析方法具有非侵入和无损的特点，近几年来，光谱技术在食源性致病菌检测领域大量研究表明，此方法可以有效替代传统检测方法，其应用也得到了迅速的发展。

光学散射是微小颗粒与光作用的主要形式，散射光特性与散射粒子的特性有直接的联系。基于弹性光散射的测量方法具有便捷且精度高等优势，能满足当前快速、在线检测的需求。我们在单细胞分析的共焦弹性散射光谱研究的基础上[51]，应该开展单菌水平快速、实时、无标记自动识别技术研究。通过建立无标记的菌体细胞共焦后向散射光谱数据库[52]，结合微流控分析平台，实现循环状态下多种混合致病菌的检测和分选，使其更有潜力应用于临床或现场检测。此外，为了将弹性散射光谱法作为一种具有广泛适用性的技术进行推广，还应该在以下几方面进行深入的探索。

(1)进一步评价光谱技术在食源性致病菌检测领域应用的可靠性。对光谱技术鉴定检测微生物的灵敏度及准确性进行评价。通过探索可行且规范的样品前处理操作标准来提高光谱分析法的准确度。

(2)随着微流控芯片技术的逐步成熟，光谱技术还将与微流控芯片分析法结合，在提高系统稳定性、简化样品前处理过程、提高检测平台的自动化程度、实现在线实时检测等方面显示出强劲的发展潜力[53]。

(3)在处理光谱信号的过程中，对建模算法进行优化，从而提高模型分类效率，实现样本信息的自动采集，建立自动化的检测系统。