响应面法优化金果榄多糖提取工艺及抗氧化活性研究

蒋德旗 柒善怀 张兰熙 赵仕花 卢燕燕

摘要：目的  研究复合酶提取金果榄多糖的最佳条件，并探讨其体外抗氧化活性。方法  复合酶种类及配比为纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，液料比固定为20 mL/g，以金果榄多糖得率为响应值，在单因素试验基础上，以酶解pH值、酶解时间、复合酶添加量、酶解温度为自变量，采用响应面法建立数学模型，筛选最佳提取工艺;采用DPPH自由基、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力体系评价金果榄多糖体外抗氧化活性。结果  金果榄多糖最佳提取条件为：酶解pH值5.1，酶解时间56 min，复合酶添加量2.0%，酶解温度52 ℃。在此条件下多糖得率为14.03%，与理论值14.12%的相对误差<5%。酶解温度对多糖得率影响最显著，酶解时间、酶解pH值次之，酶添加量影响最小。金果榄多糖对DPPH、·OH、O2-·清除的半数抑制浓度分别为1.358、0.927、1.096 mg/mL，与维生素C比较，抗氧化活性较弱。结论  本研究优选的金果榄多糖复合酶法提取工艺方便可行，酶解得到的多糖具有较强的体外抗氧化活性。

关键词：金果榄;多糖;响应面法;复合酶;抗氧化活性

中图分类号：R284.2;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）04-0085-06

金果榄为防己科植物青牛胆或金果榄的干燥块根，主要分布于我国广西、四川、贵州等西南地区。金果榄主要含有季铵生物碱、萜类、甾醇类及多糖等化学成分[1-2]，性寒味苦，具有清热解毒、清喉利咽、消肿止痛功效，临床主要用于治疗急慢性咽喉炎、扁桃体炎、菌痢、痈肿疔疖等[3-4]，有“壮药中的广谱抗菌素”之称[5]。目前对其萜类及生物碱成分的药理作用研究较多，而对金果榄多糖的相关研究鲜见报道。现代药理学研究表明，天然产物多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降低血糖及增强免疫等多种药理作用[6-8]，且生物活性强、毒副作用少[9]。本研究采用响应面法优化复合酶提取金果榄多糖的工艺条件，并探讨其体外抗氧化活性，为金果榄多糖成分进一步开发为药品及食品抗氧化添加剂提供一定的依据。

1  仪器与试药

5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf;Alpha-1506型紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司;SHA-BA双功能水浴恒温振荡器，常州华普达教学仪器有限公司;PHS-25型pH计，上海雷磁;SHB-III型循环水真空泵、2L-ARE旋转蒸发器，上海皓庄仪器有限公司。

金果榄购自广西玉林众康大药房，经玉林师范学院生物与制药学院陈晓白教授鉴定为防己科植物金果榄Tinospora capillipes Gagnep.的干燥块根;维生素C（批号100425-201709），中国食品药品检定研究院;D-无水葡萄糖（批号20171104）、超氧阴离子自由基（O2-·）和羟自由基（·OH）清除能力检测试剂盒（批号20180105），北京索莱宝科技有限公司;纤维素酶（5万U/g，批号20171205）、果胶酶（10万U/g，批号20171108）、木瓜蛋白酶（8万U/g，批号20171013），江苏锐阳生物技术公司;DPPH（批号D4313-6HOG4），日本TCI公司;其他试剂均为国产分析纯。

2  方法与结果

2.1  提取方法

多糖提取方法参照文献[10]进行，主要包括粉碎过筛（100目）、特定酶解条件下提取、高温灭活、分离浓缩、乙醇沉淀、Sevage法脱蛋白、二次醇沉、真空冷冻干燥等系列步骤。

2.2  多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以葡萄糖浓度为横坐标，490 nm波长处吸光度值为纵坐标，得标准曲线方程为Y=8.498 6X-0.018 5，r2=0.990 3，表明葡萄糖的线性范围为20～120 μg。多糖得率（%）=CnV/m×100%，C为样品稀释液中多糖浓度（mg/mL），n为稀释倍数，V为样品稀释液体积（mL），m为金果榄粉末质量（mg）。

2.3  单因素试验

酶解時的摇床转速固定为180 r/min，液料比为20 mL/g，复合酶（纤维素酶-果胶酶-木瓜蛋白酶）配比为1∶1∶1[11]，分别考察酶解pH值、酶解时长、酶添加量和酶解温度对金果榄多糖得率的影响，其中各因素固定水平为pH值5.0、酶添加量2.0%、酶解时间60 min、酶解温度50 ℃。

2.3.1  复合酶添加量

复合酶添加量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时的多糖得率见图1。当复合酶添加量增加到2.0%时，多糖得率可达13.47%，进一步加大酶用量，多糖得率无显著提升，说明在该底物浓度下酶浓度已趋于饱和，继续增加复合酶用量对多糖得率没有显著影响，故选择2.0%作为酶的最佳添加量。

2.3.2  酶解pH值

酶解pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0时的多糖得率见图2。当pH值增加到5.0时，多糖得率达到最大值13.72%，pH值为6.0时多糖得率反而减小，这主要与pH值过高或过低影响酶本身活性有关，故酶解最适pH值选定为5.0。

2.3.3  酶解温度

酶解温度分别为30、40、50、60 ℃时的多糖得率见图3。随着温度升高，多糖得率先增大后减小，这是由于温度过高导致酶活力减弱所致，故选择最适酶解温度为50 ℃。

2.3.4  酶解时间

酶解时间分别为20、40、60、80、100 min的多糖得率见图4。当酶解时间为60 min时，多糖得率为13.68%，接近80 min时的最大值13.76%，再延长提取时间，多糖得率反而减小。这是因为酶解时间过长，酶催化活性减弱，反而不利于多糖提取。考虑到实际生产效率，故选择60 min为最佳酶解时间。

2.4  响应面试验设计及结果

响应面试验设计自变量为酶解pH值、酶解时间、酶添加量、酶解温度4个因素，以多糖得率为响应值，采用Design Expert 8.06软件进行数据分析。因素水平见表1，试验设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

对表2中数据进行回归拟合，获得自变量（酶解pH、酶解时间、酶添加量、酶解温度）对金果榄多糖得率的二次多项回归方程：Y=13.86-0.19A-0.64B-0.17C+0.98D-1.86AB-0.61AC+2.07AD-0.56BC+0.41BD+0.17CD-2.06A2-2.49B2-0.74C2-1.65D2。方差分析结果显示，回归方程模型P<0.000 1，失拟项不显著（P=0.1145），模型总决定系数R2=0.980 1，调整后R2Adj=0.960 2，以上参数均说明该模型与试验数据拟合程度好，试验误差小，可用于不同变量条件下的响应值预测。

由表3中F值可知，金果榄多糖复合酶法提取影响因素主次顺序为：酶解温度（D）>酶解时间（B）>酶解pH值（A）>酶添加量（C），其中D、B两因素影响显著。因素间交互作用对金果榄多糖得率的影响见图5，由图5、表3可知，AB、AC、AD、BC交互作用显著影响金果榄多糖酶法提取的得率，其中AB、AD影响极显著，AC、BC显著，BD、CD间交互作用对多糖得率影响不显著（P>0.05）。

2.5  最佳提取条件预测及验证试验

对回归模型方程求解，获得金果榄多糖复合酶提取的最佳条件为：酶解pH值5.1，酶解时间56.3 min，酶添加量2.0%，酶解温度52.2 ℃。在此条件下，理论多糖得率为14.12%。考虑实际操作方便，将上述最佳提取工艺参数修改为：酶解pH值5.1，酶解时间56 min，酶添加量2.0%，酶解温度52 ℃。按照该工艺条件进行3次验证试验，结果多糖得率平均值为（14.03±1.25）%，与理论多糖得率的相对误差为0.64%，提示本法得到的回归模型有效、可靠，该复合酶提取金果榄多糖工艺条件具有实际应用价值。

2.6  体外抗氧化活性测定

参照文献[11]方法测定金果榄多糖清除DPPH自由基、O2-·能力，检测波长分别为517、320 nm。测定金果榄多糖清除·OH能力的具体步骤按照试剂盒说明书进行，检测波长536 nm。抗氧化活性检测均选择维生素C作为对照。样品金果榄多糖及维生素C的质量浓度梯度设置为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL。

2.6.1  金果榄多糖对DPPH自由基清除作用

金果榄多糖对DPPH自由基清除作用见图6。当金果榄多糖浓度在0.2～3.0 mg/mL时对DPPH自由基清除率稳步提升，浓度为3.0 mg/mL时，金果榄多糖对DPPH自由基清除率为81.96%，维生素C对DPPH自由基清除率可达90.45%，金果榄多糖清除DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）为1.358 mg/mL，维生素C的IC50为0.867 mg/mL，两者比较，金果榄多糖清除能力弱于维生素C。以上结果提示金果榄多糖具有一定的DPPH自由基清除作用。

2.6.2  金果榄多糖对羟自由基清除作用

金果榄多糖对羟自由基清除作用见图7。当金果榄多糖浓度在0.2～3.0 mg/mL时对·OH清除率不断增大，而维生素C在浓度1.8 mg/mL时对·OH清除率已接近最大值，之后趋于稳定。当浓度为3.0 mg/mL时，金果榄多糖对·OH清除率为92.05%，维生素C对·OH清除率为96.74%，金果榄多糖清除·OH的IC50为0.927 mg/mL，维生素C的IC50为0.591 mg/mL，两者比较，维生素C对·OH清除能力强于金果榄多糖。以上结果提示金果榄多糖具有較好的·OH清除作用。

2.6.3  金果榄多糖对超氧阴离子自由基清除作用

金果榄多糖对超氧阴离子自由基清除作用见图8。当金果榄多糖浓度在0.2～3.0 mg/mL时对O2-·清除率稳步提升，浓度为3.0 mg/mL时，金果榄多糖对O2-·清除率为83.12%，维生素C对O2-·清除率为91.48%，金果榄多糖清除O2-·的IC50为1.096 mg/mL，维生素C的IC50为0.804 mg/mL，两者比较，金果榄多糖对O2-·清除能力弱于维生素C。以上结果说明金果榄多糖具有较好的O2-·清除作用。

3  讨论

酶法提取中药有效成分操作简单、条件较温和、节约能源、不需要大型设备，并且在成分结构与生物活性保持方面具有一定的优势[12]。本研究在单因素试验基础上，通过响应面优化设计考察了金果榄多糖复合酶法提取的工艺。结果发现，金果榄多糖最佳酶解提取条件为：酶解pH值5.1，酶解时间56 min，复合酶添加量2.0%，酶解温度52 ℃，液料比20 mL/g。在此最佳工艺条件下，金果榄多糖得率为14.03%，与回归模型方程预测值14.12%比较，相对误差<5%。4个影响因素中，酶解温度对金果榄多糖得率的影响最明显，其次是酶解时间和酶解pH值，而复合酶添加量对多糖得率影响最小。赵成刚等[13]采用热水浸提法提取金果榄多糖，在提取时间1.5 h、提取温度80 ℃、料液比1∶20、提取3次的工艺条件下，多糖得率为13.64%，稍低于本研究中复合酶法提取获得的金果榄多糖得率。本研究选择的酶法提取温度为52 ℃，明显低于热水浸提法所需的80 ℃，提取温度低在多糖成分结构与活性保持及节能方面具有一定优势。且酶法提取时间也比水提法明显缩短，可在一定程度上提高生产效率。

机体多种疾病如炎症、心脑血管病等的产生均与自由基及其代谢产物诱发机体氧化损伤有关。邓晓梅[14]研究指出，金果榄总皂苷对·OH、亚硝酸盐、O2-·的清除能力随其浓度增大而递增。目前有关金果榄多糖抗氧化活性的研究很少见。本研究发现，金果榄多糖对DPPH自由基、·OH、O2-·均具有较强的清除能力，且浓度与自由基清除能力呈现一定的正相关关系;但与维生素C比较，金果榄多糖对DPPH自由基、·OH、O2-·的清除能力较弱。本研究结果可为金果榄多糖药用价值的开发及其抗氧化活性的深入研究提供一定的依据。

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（收稿日期：2018-07-31）

（修回日期：2018-08-17;编辑：陈静）