线粒体分裂/融合在高糖诱导足细胞损伤中的作用

廖奕娇，陈奕君，何日明，刘新辉，杨曙东△

(1.广州中医药大学第四临床医学院肾病科，广东深圳 518033；2.广东省深圳市中医院肾病科 518033)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是我国终末期肾脏病(ESRD)的第二位原发病，并且其患病率和发病率均呈现快速增长趋势[1]。DN患者因高糖血症而引起肾小球基底膜增厚、系膜扩张及细胞外基质增生，使肾小球高滤过、产生蛋白尿，最终由慢性肾功能不全进展为ESRD[2]。足细胞是肾小球脏层上皮细胞，其结构的损伤及功能的改变都会影响肾小球滤过膜的通透性，是评估肾小球滤过膜通透性的重要生物标志物[3]。高糖对足细胞的损伤所导致的滤过膜屏障破坏是DN产生蛋白尿的主要原因[4]。podocin作为足细胞裂孔隔膜的主要蛋白分子，是足细胞损伤的重要标志，在维持足细胞的正常形态和功能及蛋白尿发生中起重要作用[5]。

A:未分化细胞；B:对照组；C:60 mmol/L组

图1 足细胞形态变化(×100)

近年来的研究表明，线粒体在DN发生、发展中起重要作用。线粒体是一个动态细胞器，其形态的维持依靠线粒体分裂和融合机制。线粒体分裂和融合可增加细胞应激抵抗力，分裂/融合的异常与疾病的发生密切相关[6]。然而，目前有关高糖刺激对足细胞线粒体分裂/融合影响的文献报道甚少。本研究拟通过观察不同浓度葡萄糖对体外培养的人足细胞线粒体分裂/融合相关蛋白的调控，以探讨高糖诱导足细胞损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1细胞与材料

1.1.1永生化人足细胞AB8/13(英国布里斯托大学Moin A.SALEEM教授馈赠)。RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰岛素-转铁蛋白-硒溶液(ITS)、双抗及胰酶(美国Gibco公司)。抗体：足突蛋白(podocin)、线粒体融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)及Mfn2(英国Abcam公司)；线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor，Mff)、线粒体动力蛋白(MiD49，美国Proteintech公司)；视神经萎缩症蛋白1(optic atrophy 1，OPA1,美国BD Biosciences公司)；二抗(CST公司)。仪器：超净工作台(新加坡ESCO公司)；CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；全自动凝胶成像和化学发光图像分析系统(美国ChemiDocTMMP Imaging System公司)、垂直电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad Laboratories公司)；酶标仪(美国BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1足细胞培养 足细胞快速复苏后用含10%FBS、1% ITS及1%双抗的RPMI-1640培养基于33 ℃培养箱中进行增殖。每1～2天换液1次。细胞生长融合至80%～90% 时用0.25% 胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]溶液消化、传代。将一部分细胞转移至37 ℃培养箱用含5% FBS及1%双抗的RPMI-1640培养基诱导分化10 d后用于后续实验。

1.2.2实验分组 对照组：普通RPMI-1640培养基；高糖刺激组的葡萄糖浓度分别为30(30 mmol/L组)、45(45 mmol/L组)、60 mmol/L(60 mmol/L组)。刺激时间为48 h。

1.2.3蛋白免疫印迹(Western blot) 细胞分组刺激后吸除培养液，以预冷的0.01 mol/L PBS洗涤2次。加入1×细胞裂解液80～100 μL/皿并均匀覆盖，置于冰上裂解10～15 min。用细胞刮仔细刮下细胞蛋白并吸入EP管内，离心(4 ℃，12 000×g，10 min)后将上清液转入另一EP管；电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭60 min；孵育一抗、二抗，曝光显影，图像分析。

2 结 果

2.1足细胞形态变化 与未分化细胞相比，经过10 d分化的对照组足细胞可见足突生成(箭头所示)。而经60 mmol/L高糖刺激48 h后足突广泛减少甚至消失，见图1。

A:Western blot图；B:Western blot分析图；1:对照组；2:30 mmol/L组；3:45 mmol/L组;4:60 mmol/L组；a:P<0.05,与对照组比较

图2 各组细胞podocin表达

A:Western blot图；B、C:Western blot分析图；1:对照组；2:30 mmol/L组；3:45 mmol/L组;4:60 mmol/L组；a:P<0.05,与对照组比较

图3 各组细胞线粒体分裂相关蛋白表达

A:Western blot图；B、C、D:Western blot分析图；1:对照组；2:30 mmol/L组；3:45 mmol/L组;4:60 mmol/L组；a:P<0.05,与对照组比较

图4 各组细胞线粒体融合相关蛋白表达

2.2足细胞标志蛋白podocin表达的变化 Western blot结果显示，高糖刺激可呈浓度依赖性下调podocin表达，其中60 mmol/L组足细胞podocin蛋白表达显著下调，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，为正常对照组0.63倍，见图2。

2.3线粒体分裂相关蛋白表达 高糖刺激可呈浓度依赖性增加线粒体分裂相关蛋白MiD49及Mff的表达。其中，60 mmol/L组与对照组比较，MiD49表达显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，60 mmol/L组Mff表达较对照组上调，表达水平为对照组的1.33倍，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.4线粒体融合相关蛋白表达 各浓度的高糖刺激对足细胞线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1的表达均有一定下调作用。其中，30、45、60 mmol/L组均可显著下调Mfn1表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4A、B。45 mmol/L组与60 mmol/L组Mfn2表达较对照组显著下调(P<0.05)，见图4A、C。60 mmol/L组OPA1表达较对照组显著下调(P<0.05)，见图4A、D。

3 讨 论

DN表现的持续蛋白尿与足细胞裂孔隔膜密切相关，裂孔隔膜的完整性是肾小球滤过机械屏障的关键[7]。podocin是分布于裂孔膜的跨膜蛋白，起到细胞骨架连接桥梁作用，是防止清蛋白滤出的关键分子蛋白，但裂孔膜分子易受损害，一旦发生突变则会破坏肾小球滤过膜的完整性，产生大量蛋白尿[8]。国内外已有不少研究表明高糖环境下足细胞的增殖降低，出现podocin蛋白表达明显下调的现象[9-11]。

线粒体的分裂与融合对其正常功能的发挥具有非常重要的作用，线粒体通过不断活跃的分裂/融合可稳定线粒体的形态及分布[12]。线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2及OPA1等，其分裂蛋白则有MiD49、Mff等。Mfn1和Mfn2是线粒体融合的关键介导蛋白，Mfn1主要在融合的前期促进线粒体间的彼此结合，Mfn2则主要在线粒体融合反应的后期起作用[13]。OPA1位于线粒体内膜上，具有促进线粒体融合的功能，可使嵴连接处于关闭状态，以维持嵴的形态[14-15]。MiD49、Mff可以募集动力相关蛋白1促进线粒体裂变，且MiD49在Mff缺失的情况下，仍可推动分裂的进行[16]。本研究用不同浓度葡萄糖对足细胞作用48 h，与对照组比较，60 mmol/L的高糖刺激可引起足细胞形态结构发生明显变化，细胞数量显著减少，且由实验数据可知podocin表达明显下调。同时，由Western blot结果可知60 mmol/L高糖可上调线粒体分裂相关蛋白、下调线粒体融合相关蛋白，表明线粒体形态调控在高糖的作用下发生了明显的变化。

综上所述，高糖可能通过增加线粒体分裂、减少线粒体融合诱导足细胞损伤及形态异常。该研究从线粒体形态调控的角度阐明了高糖诱导足细胞损伤的机制及可能靶点，为下一步治疗药物的筛选奠定了实验基础。