清营汤联合恩诺沙星干预S.Typhimurium复发性感染的C57BL/6小鼠模型研究*

唐宋琪，孙 涛，陈云慧，冷 平△

1.海南医学院(海口 571199)； 2.成都中医药大学(成都 611137)

沙门氏菌(salmonella)感染是一个严重的公共健康问题，不仅影响发展中国家的经济建设，发达国家也饱受困扰[1-2]。尽管沙门氏菌对抗生素的治疗反应迅速，但由于疗程及细菌特殊状态等因素导致杀菌不彻底，体内存留的沙门氏菌往往成为复发性感染或反复发作性感染的根源[3]。中药治疗感染性疾病的历史悠久、疗效确切，中药联合抗生素的治疗方案优势特色明显，主要表现为增效减毒作用[4]。已往研究[5]发现，中药复方清营汤具有养阴透热，清营解毒之功效，临床广泛用于治疗感染性疾病和炎性疾病。本研究通过建立鼠伤寒沙门氏菌(salmonella.Typhimurium，S.Tm)感染C57BL/6小鼠模型，评价中药复方清营汤联合抗生素恩诺沙星干预S.Tm感染复发的作用效应，为中药联合抗生素防治沙门氏菌复发性感染提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠，SPF级，6～8周龄，雌雄各108只，体重(18±2)g。购自成都达硕实验动物有限公司SCXK(川)2014-028，饲养于海南医学院动物实验室SYXK(琼)2012-0013。经海南医学院实验动物福利与伦理委员会批准。

1.1.2 菌株S.Tm菌株由英国帝国理工学院Boyle教授惠赠。

1.1.3 药品 5%恩诺沙星注射液(Bayer，德国)；清营汤(《温病条辨》)：犀角(水牛角代)30 g、生地黄15 g、元参9 g、竹叶心3 g、麦冬9 g、丹参6 g、黄连5 g、银花9 g、连翘6 g，购自四川新荷花中药饮片股份有限公司。

1.1.4 主要试剂 LB琼脂粉(Cat.22700025，Invitrogen，美国)；LB液体培养基(Cat.10855021，Gibco，美国)；PBS缓冲液(Cat.70011044，Gibco，美国)；MEM Hank's培养液(Cat.11575032，Gibco，美国)；FBS胎牛血清(Cat.10099141，Gibco，美国)；NaHCO3(天津致远)。

1.1.5 主要仪器 Heratherm微生物培养箱(Thermo Scientific，美国)；全自动化学发光凝胶成像系统(Champ Chemi 610，北京赛智)

1.2 实验方法

1.2.1 清营汤药液制备 先将水牛角置煎器内加水1 000 mL煎煮1 h，然后加入生地黄、元参、麦冬、丹参、黄连5味药煎煮30 min，最后加入银花、连翘、竹心3味药煎煮10 min，滤取药液。药渣加水600 mL，再煎20 min，滤取药液。将两次煎出液合并，浓缩为1 g生药/mL，备用。

1.2.2 恩诺沙星药液制备 使用灭菌蒸馏水将5%恩诺沙星注射液(100 mL∶5 g)稀释为2 mg/mL，备用。

1.2.3 染毒菌液制备S.Tm菌划线接种于LB固体培养基，37 ℃培养过夜。挑取单个菌落培养于LB液体培养基，37 ℃，静置培养过夜。4 ℃，5 000 g/min，离心10 min，收集细菌，采用PBS缓冲液调节细菌浓度为2×1010CFU/ mL，备用。

1.2.4 小鼠S.Tm肠道感染模型建立 每只小鼠灌胃3% NaHCO3溶液200 μL，随后灌胃给予S.Tm菌液200 μL(含菌量4×109CFU)。染毒2 d后，开始分组干预。

1.2.5 动物分组 小鼠造模2 d后，随机分为：模型组(Model)、恩诺沙星组(Enrofloxacin，ENR)、清营汤+恩诺沙星组(QENR)；小鼠生存率及粪便脱落细菌检测，每组设置小鼠10只；小鼠MLN组织载菌量检测，设置14个时间点亚组，每个亚组小鼠6只；为避免粪便造成交叉感染，所有小鼠均单笼饲养。

1.2.6 干预方法 模型组小鼠正常饮食饮水，每日按0.4 mL/10 g体重灌胃注射用灭菌水；恩诺沙星组小鼠在饮水中加入恩诺沙星浓度为2 mg/mL，每日按0.4 mL/10 g体重灌胃注射用灭菌水；清营汤+恩诺沙星组小鼠在饮水中加入恩诺沙星浓度为2 mg/mL，同时每日按临床等效剂量15 g生药/kg体重灌胃清营汤药液。连续干预7 d。

1.2.7 指标检测 小鼠一般状态观察 每天观察小鼠体征并记录，当小鼠濒临死亡时(用手指轻轻戳动小鼠，未显示任何运动)，脱颈处死。小鼠肠系膜淋巴结(mesenteric Lymph Nodes, MLNs)细菌定植检测 每隔2 d从各干预组的时间点亚组中随机抽取1组小鼠处死，解剖取出小鼠MLN，置2% FBS-MEM Hank's液中匀浆，连续稀释后，接种于LB固体培养基，37 ℃培养过夜，采用凝胶成像系统对菌落进行全自动计数。小鼠粪便脱落细菌检测 收集小鼠粪便颗粒称重，PBS液中均质后，连续稀释，接种于LB固体培养基，37 ℃培养过夜，采用凝胶成像系统对菌落进行全自动计数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 清营汤联合恩诺沙星对S.Tm肠道感染小鼠生存率的影响

小鼠经口感染S.Tm后，模型组小鼠在第3天(对应其它组抗生素治疗第1天)出现异常表现：自发活动明显减少、困倦，被毛竖立等；从感染第4天开始，模型组小鼠陆续死亡，至感染后第8天全部死亡(对应其它组抗生素治疗第6天)。恩诺沙星组及清营汤+恩诺沙星组小鼠在药物干预期间未发生死亡。停药后第3天，恩诺沙星组部分小鼠开始出现自发活动减少。从停药后第7天开始，恩诺沙星组小鼠出现死亡，至停药后14 d全部死亡(即抗生素治疗后第21天)。清营汤+恩诺沙星组小鼠在停药后出现异常表现及发生死亡比恩诺沙星组晚(停药后第6天开始出现异常体征；停药后第8天第一只小鼠死亡)，4只小鼠至实验结束未发生死亡，且一般状态良好，生存率为40%(图1)。

图1 S.Tm感染小鼠生存率

2.2 清营汤联合恩诺沙星对S.Tm肠道感染小鼠MLN载菌量的影响

小鼠接受恩诺沙星治疗后，对抗生素的反应非常迅速，表现为MLN组织载菌量较模型组明显减少，4 d后基本杀灭了MLN中的细菌，平板法检测不到细菌(图2)。然而，停药1 d后，恩诺沙星组小鼠MLN组织中再次检测到细菌，载菌量随时间呈指数增加，且与小鼠的感染体征和死亡具有同步性(图1)，提示原发感染出现复发。清营汤+恩诺沙星组小鼠MLN组织中细菌清除速度较恩诺沙星组稍快，停药后，部分小鼠MLN组织中再次检测到细菌，在同一时间点细菌的检出比例较恩诺沙星组低，然而细菌一旦检出，其随时间变化的载菌量与恩诺沙星组并无差异(图3)。

图2 S.Tm感染小鼠MLN细菌含量

注：模型组小鼠在感染后第8天全部死亡，此后检测数据缺失；恩诺沙星组小鼠在治疗后第21天全部死亡，此后检测数据缺失；N.D.表示未检测到细菌

图3 S.Tm感染小鼠MLN组织细菌检出率

2.3 清营汤联合恩诺沙星对S.Tm肠道感染小鼠粪便脱落细菌的影响

小鼠接受恩诺沙星治疗后，4 d左右细菌不再从小鼠粪便中排出。在停用抗生素治疗后，恩诺沙星组小鼠从第3天开始恢复细菌排泄，在检测到新的粪便排菌后不久，排菌小鼠出现明显的感染体征，最终死于复发性感染。清营汤+恩诺沙星组小鼠出现粪便排菌的时间与恩诺沙星组无差异，但粪便细菌检出率明显低于恩诺沙星组。至实验结束，清营汤+恩诺沙星组存活小鼠粪便中始终未检出细菌(图4)。

图4 S.Tm肠道感染小鼠粪便脱落细菌检出率

3 讨论

沙门氏菌感染的复发通常发生在抗生素治疗后，是人类伤寒的一个常见而明显的临床现象。长疗程的抗生素治疗方案依从性欠佳，并且造成巨大的经济负担，尤其是在发展中国家[6]。因此，人们更希望寻找短疗程的治疗方案，但困扰短疗程抗生素治疗方案的瓶颈是感染复发问题。国外研究[7]发现，沙门氏菌的复发感染主要是由于该细菌可形成“非复制型持续细胞”状态而存留于人体内。沙门氏菌在抗生素压力下，部分细菌的复制速度减慢，甚至停止复制，这一状态的特点是细菌对抗生素不再敏感，产生耐药现象。当抗生素撤去之后，细菌再次恢复复制能力，并可重新感染其它宿主细胞。沙门氏菌潜伏体内，伏而再发的现象与中医温病学伏气致病的病机具有宏观相似之处。中医针对伏气致病常采用透邪外达、透营转气等治法，其经典代表方为清营汤，临床将该方作为主方大量应用于温热性感染疾病的治疗。

据此，我们推测中医透邪外达治法及其代表方清营汤可能通过影响沙门氏菌“非复制型持续细胞”状态的形成，提高其对抗生素的敏感性，增强抗生素的杀菌作用，缩短疗程，预防复发。为了证实这一假说，我们设计了本文研究。在本文研究中，重点关注了干预措施对MLN载菌量的影响，据文献报道，MLN是沙门氏菌形成“非复制型持续细胞”的主要场所，且与粪便排菌密切相关[7-8]。本研究发现，未经抗生素治疗的小鼠，在感染后8 d内全部死亡。接受抗生素治疗的小鼠全部存活，7 d的抗生素疗程足以杀灭小鼠MLN组织内的沙门氏菌，同时粪便中脱落的细菌也未能检出。当抗生素撤去1 d之后，即有小鼠MLN组织中再次检测到细菌，3～7 d后粪便中也再次检测到细菌，并出现感染复发的体征，最终死亡。然而，清营汤联合抗生素治疗后的小鼠不论是在MLN组织中还是在粪便中检测到细菌的时间均较单纯接受抗生素治疗的小鼠晚，并且最终约有40%的小鼠存活。

综上所述，清营汤联合恩诺沙星治疗沙门氏菌感染可有效减少复发性感染的发生率，发挥对抗生素的增效作用。