划布轮法鉴定新疆野苹果树腐烂病抗性方法的建立

刘晓洁，李小双，张 燕，梁玉青，周 平，赵津艺，张道远

(1.中国科学院 干旱区生物地理与生物资源重点实验室，新疆生态与地理研究所，乌鲁木齐 830011；2.中国科学院大学，北京 100049；3.利物浦大学，英国利物浦 L69 3BX)

苹果树腐烂病是由苹果黑腐皮壳(Valsamali)引起的枝干皮层腐烂的、严重危害苹果树的一种病害[1]，该病在世界范围内发生，病菌属于子囊菌门，黑腐皮壳科，黑腐皮壳属[2-3]。新疆野苹果(Malussieversii,又名塞威士苹果)，分布于天山山脉，包括中国新疆伊犁地区和中亚5国。在中国，新疆野苹果集中分布于新疆伊犁的巩留、新源、霍城及裕民等地[4]。在中亚，新疆野苹果分布在哈萨克斯坦、吉尔吉斯坦、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦和土库曼共和国[5]。新疆野苹果种质资源丰富，具有很高的遗传多样性[6]，研究证明新疆野苹果是现代栽培苹果(Malusdomestica)的祖先[7]，具有很重要的科研和保护价值。然而，近10 a来，由于多种原因，新疆野苹果林遭受了毁灭性的生态危害，大面积的野苹果纯林衰败甚至死亡，腐烂病的爆发成为野苹果林大面积死亡的重要原因之一[8]。经过野外调查发现，野苹果腐烂病抗性表现不同，有些植株易感，有些植株则抗性强。因此，从自然种群中快速筛选鉴定强抗腐烂病植株并进行研究及应用是一项重要任务。

目前，苹果腐烂病鉴定方法主要是烙铁烫伤树枝接菌法和针刺叶片接菌法，烙铁烫伤和针刺方法会对植物造成大小不均一伤口，因个人操作原因重复之间不能保证伤口一致性，从而导致较大误差，且过程操作繁琐，更不便于在野外大规模操作。因此，需要研制一种简便易行、准确高效的、尤其适用于野外大样本量的新疆野苹果腐烂病抗性株快速筛选鉴定方法。

本研究构建了一套腐烂病病原菌培养-野外接菌-抗性株鉴定的技术方法，对新疆野苹果离体枝条和叶片进行接菌鉴定，并对此方法进行了评价。

1 材料与方法

1.1 病原菌材料与培养

苹果腐烂病(Valsamali)强致病性03-8菌株[9]，由西北农林科技大学黄丽丽教授惠赠。用打孔器(直径5 mm)菌落边缘打孔，取菌饼长有菌丝一面接于PDA平板中心，25 ℃暗培养3 d待用。

1.2 植物材料

1.2.1 室内植物材料 从新疆野苹果自然分布区新疆伊犁新源县改良场苗圃基地(N43°23′2.20″,E83°35′43.48″)随机选择生长健康和状态较一致的3 a生新疆野苹果幼苗，携土带回实验室种植于花盆中，备用；哈萨克斯坦吐尔根地区(N43°22.138′,E77°40.300′)，奇姆肯特地区(N42°40.946′,E70°14.795′)野苹果林采集野苹果叶片，保湿处理带回实验室。

1.2.2 田间植物材料 从新疆野苹果自然分布区新疆伊犁新源县改良场苗圃基地(N43°23′2.20′′,E83°35′43.48′′)随机选择生长健康且状态较一致的3 a生新疆野苹果幼苗50株，并从每株幼苗上选取完全展开、大小均一的叶片各5片，连叶柄处剪下，在原地进行腐烂病接菌及抗性鉴定试验。

1.3 室内腐烂病接菌

1.3.1 枝条接菌方式的确定 采用划布轮(直径2 cm)进行新疆野苹果离体材料的刺伤。选取健康的新疆野苹果枝条，截成15 cm长的小段，水冲洗干净表皮后用体积分数为70%酒精浸泡10 min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用石蜡封口待用；用浸泡70%酒精的脱脂棉球擦拭消毒划布轮，待酒精晾干用划布轮刺伤树皮，刺伤长度至2 cm，备用。

离体枝条接菌试验采用刘开启等[10]的方法，用打孔器在已培养好的腐烂病菌株03-8菌落边缘打孔，取菌饼长有菌丝一面贴合在烫伤部位，以灭菌的PDA固体培养基作为对照，在接菌上方0.5 cm处覆一块灭菌ddH2O(800 μL)浸湿的脱脂棉，紧密地包裹枝条刺伤部位，使菌饼充分与伤口结合，再用封口膜将其同时包扎，切勿移动菌饼位置以防菌饼脱离刺伤伤口；将滤纸浸湿铺平托盘，再将已接好菌的树枝平放置托盘，用保鲜膜覆盖好托盘，放置25 ℃培养8 d。

1.3.2 室内叶片接菌 选取完全展开、大小均一的新疆野苹果叶片，连叶柄处剪下，用ddH2O将叶片洗净，70%的酒精棉球擦拭消毒叶片表面，再用已灭菌ddH2O冲洗干净叶片表面并晾干，用已消毒的划布轮沿叶片主叶脉方向滑动刺伤叶片，刺伤伤口约2 cm(远离主叶脉)，待用。

室内离体叶片接菌试验采用Wei等[11]的方法，在培养皿中平铺滤纸，加入已灭菌ddH2O使滤纸完全浸湿，再弃去多余水，放入叶片；长有菌丝面的菌饼贴合在刺将伤伤口处，以灭菌的PDA固体培养基作为对照，盖好培养皿，用封口膜封住培养皿以便保湿，25 ℃培养4 d。

1.4 田间腐烂病接菌

1.4.1 田间叶片接菌 在新疆伊犁新源县改良场苗圃基地，选取采下的叶片(共50株，每株5片叶片)在室外直接进行划布轮刺伤接菌试验，方法同“1.3.2”室内叶片接菌方法，将托盘带回室内，25 ℃保湿培养4 d。

1.5 新疆野苹果腐烂病抗性评价方法

1.5.1 枝条发病率、平均病斑长度和严重度 枝条接菌处理后第8天，记录枝条发病个数，用游标卡尺测量发病枝条病斑长度，根据记录的发病枝条个数和枝条病斑长度，可计算出枝条发病率，平均病斑长度，即严重度[12-13]。

发病率=每处理发病孔数/接种数×100%

平均病斑长度=∑发病孔病斑长度/发病孔数

1.5.2 叶片病斑面积和叶面积 叶片接菌处理第4天，参考Stewart等[14]和Abramoff等[15]的方法，拍照并用软件Image J(Rasband,W.S.,Image J; U. S. National Institutes of Health,http://imagej.nih.gov/ij/,1997-2012)分析测量叶片病斑面积(mm2)和叶片面积(mm2)，根据记录可计算出叶片病斑面积比率。

叶片病斑面积比率=病斑面积/对应叶片面积×100%

1.6 数据分析

用软件SPSS 18.0进行one-way ANOVA数据统计，以植株2的值为参照(表1)，用LSD进行显著性(P<0.05,P<0.01)分析。根据刘欣颖等[12]建立的苹果种质资源腐烂病抗病性评价分级标准，将苹果腐烂病严重度分为5个抗性等级，即发病率分为：极低Very low(μ≤5%)，低Low(5%<μ≤10%)，较低Moderately low(10%<μ≤25%)，高High(25%<μ≤50%)，极高Very high(μ>50%)；严重度：极轻Very light(M≤10 mm)，轻Light(10 mm70 mm)。发病率和严重度分别代表植物材料的抗侵入能力和抗扩展能力。

2 结果与分析

2.1 腐烂病菌接菌方法建立

2.1.1 枝条叶片不同伤害表型 使用电烙铁烫伤枝条产生褐色烫伤斑(图1-A)，烫伤面积约 1 cm2，相对于划布轮刺伤枝条产生的整齐、均一的刺伤伤口(图1-B)，伤口面积较大且每次烫伤形成的伤口不均一；使用划布轮刺伤叶片形成的伤口，长度约为1 cm(图1-D)，相对于使用注射器针头刺伤叶片10次造成刺伤伤口(图1-C)，较为整齐，伤口长度一致。

2.1.2 接菌枝条和叶片表型 经划布轮刺伤后，接菌处理的新疆野苹果枝条和叶片，分别在第8天和第4天出现深褐色水渍状病斑，如图2所示，并在伤口处繁殖出大量菌丝体，表明接菌成功。

A.电烙铁烫伤枝条 Burn of twig by electric soldering iron；B.划布轮刺伤枝条 Puncture on twig caused by pattern wheel；C.针头刺伤叶片 Puncture on leaf caused by syringe needle；D.划布轮刺伤叶片 Puncture on leaf caused by pattern wheel

图1不同伤害方法在新疆野苹果枝条叶片的表型
Fig.1DifferentkindsofwoundontwigsandleavesofM.sieversii

A.电烙铁烫+腐烂病菌03-8 Burn of twig by electric soldering iron+03-8; B. 划布轮刺伤枝条+腐烂病菌03-8 Puncture on twig caused by pattern wheel+03-8; C. 针头刺伤叶片腐烂病菌03-8 Puncture on leaf caused by syringe needle+03-8; D. 划布轮刺伤叶片腐烂病菌03-8 Puncture on leaf caused by pattern wheel+03-8

图2新疆野苹果枝条和叶片经不同伤害后接菌腐烂病菌03-8发病表型
Fig.2LesionsoftwigandleafofM.sieversiiinoculatedwithisolate03-8afterdifferentwounds

2.2 新疆野苹果腐烂病抗性株鉴定方法及评价

2.2.1 不同株枝条抗病性差异 随机选取5株新疆野苹果树，每株选取3根枝条经划布轮刺伤接菌腐烂病菌分离株03-8，对其接菌后第8天的发病率及平均病斑长度的分析结果显示(表1)，这5株新疆野苹果树在接菌第8天均发病，发病率为100%(极重)；其中植株1的平均病斑长度最长为113.09±5.67 mm，而植株2平均病斑长度最短，为24.56±2.35 mm，其他株平均病斑长度为45～80 mm，说明划布轮刺伤接菌的方法快速有效；植株2严重度为轻，植株3、4严重度为重，植株1、5严重度为极重。通过对每株发病率、平均病斑长度和严重度的统计分析，可以显著区分不同种质资源的抗病性差异。

表1 5株新疆野苹果离体枝条接菌03-8发病率和平均病斑长度Table 1 Disease incidence and mean lesion length on excised twigs of 5 M.sieversii trees inoculated with isolate 03-8

注：数据为3次平行试验，LSD分析， “**”表示P<0.01。

Note：The data are LSD analysis of 3 parallel experiments (P<0.01). The asterisk(**) indicates that the significance is less than 0.01.

2.2.2 不同株叶片抗病性差异 随机选取50株新疆野苹果树叶，每株各取5片，叶片经划布轮刺伤后接菌腐烂病分离株03-8，处理第4天形成病斑(图3-A)，使用SPSS 18.0软件对其接菌后第4天的叶片相对病斑面积比进行one-way ANOVA方差分析，以植株43的值为参照，进行LSD显著性(P<0.05,P<0.01)分析，结果表明划布轮刺伤接菌叶片平均病斑面积比(图3)存在差异，其中植株43有最小叶片平均病斑面积比7.20%±2.85%，植株35有最大叶片平均病斑比为87.20%±3.08%，两植株存在显著差异。所检测得50株新疆野苹果幼苗中，有9株叶片平均病斑面积比小于20%，有5株叶片平均病斑面积比在60%以上，其余介于两者之间，说明划布轮刺伤接菌可以使叶片成功发病，并成功鉴定腐烂病抗性差异植株。

此外，进一步用此方法对哈萨克斯坦野果林随机采集带回的叶片进行腐烂病接菌，并于4 d后拍照得到发病表型(图4)，结果显示不同野苹果树具有不同的叶片平均病斑面积比率，表明利用该方法可以初步、快速地鉴定新疆野苹果腐烂病抗性差异植株。

A．新疆野苹果离体叶片田间接病斑 Lesions of excised leaves in field ofM.sieversii；B.哈萨克斯坦吐尔根地区野苹果离体叶片室内接菌病斑 Lesions of laboratory excised leaves in wild apple of Turgen,Kazakhstan；C.哈萨克斯坦奇姆肯特地区野苹果离体叶片室内接菌病斑 Lesions of laboratory excised leaves in wild apple of Chimkent,Kazakhstan

图3野苹果离体叶片接菌腐烂病菌03-8病斑表型
Fig.3LesionsofleavesofM.sieversiiinfieldinoculatedwithisolate03-8

3 讨 论

研究腐烂病病害的传统方法为枝条烫伤伤口接菌法。离体枝条用烙铁烫伤后接菌饼，是一种较好的致病力鉴定方法，通过此方法已鉴定出不同腐烂病分离株致病力差异[9]。Chang等[16]和Rozsnyay等[17]也曾使用烫伤桃和樱桃离体枝条鉴定Cytospora的致病性。然而，烙铁烫伤枝条法也存在许多问题，如烫伤时间、烫伤深浅程度、烫伤面积都不能保持一致，使得烫伤伤口不均一，因个人主观因素造成误差。Bessho等[18]发现，烙铁烫伤时间长短直接影响接菌病斑大小。这些都会对腐烂病接菌试验产生误差，从而进一步影响腐烂病致病机制的研究。

采用LSD方法进行显著性分析，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01 The data in the figure are LSD analysis(P<0.05,P<0.01). The asterisk(*) indicates that the significance is less than 0.05,asterisk(**) is less than 0.01

图450株新疆野苹果离体叶片田间接菌03-8叶片平均病斑面积比
Fig.4TheMeanpercentageofleafareacoveredbylesion(PLACL)onexcisedleavesof50M.sieversiitreesinfieldinoculatedwithisolate03-8

本研究发现，用划布轮刺伤枝条和叶片表面接菌饼的方法，25 ℃保湿培养，枝条可在第3天开始发病，并在第8天统计结果，发病率达100%，平均病斑长度为24～114 mm，与臧睿等[9]利用烫伤方法所形成深褐色、水渍状的病斑一致，但本方法操作更为简易且可重复性强，并且通过统计枝条病斑严重度，可以显著区分不同种质资源的抗病性差异。叶片可在第2天开始发病，第4天测算叶片平均病斑比率，分布在7%～88%之间，经过显著性分析，可鉴定出50株新疆野苹果腐烂病抗病性差异。完全展开叶片材料本身均一性较好，误差小，鉴定结果稳定，适宜作为接种材料的致病力鉴定体系，这与Wei等[11]观点相一致。本研究使用划布轮为刺伤工具，刺伤枝条和叶片，这种接菌方式主要有以下优点：(1)划布轮小巧轻便，操作简单，适用于实验室和田间试验；(2)快速高效接菌，形成的刺伤伤口大小均一，伤口长度可控，减少误差；(3)对植株造成的伤害程度低，使试验结果更准确。

该方法发病时间短且发病稳可信，能准确稳定地建立腐烂病-苹果病症模型，鉴定腐烂病菌株致病力以及苹果腐烂病抗性株筛选。因此可用于腐烂病机制研究和种质腐烂病抗病性初级筛选，为新疆野苹果林保护与生态恢复提供技术支撑。