MicroRNA-134 对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

植创，李明星，罗会芳

（西南医科大学附属医院 1.超声科，2.妇产科，四川 泸州 646000）

宫颈癌是我国近年来发病率较高的女性生殖系统肿瘤之一[1]。宫颈癌患者早期多以下腹隐痛、阴道流血及体重减轻等亚临床表现为主，大多数患者就诊时的临床分期已较晚而失去行根治性手术的机会。因而研究调节宫颈癌细胞生长的分子指标对提高宫颈癌患者手术切除率及改善患者长期预后具有重要作用。

MicroRNA（简称miRNA）是一类短的、单链RNA，其长度分布于18 ～25 个碱基之间[2]。在宫颈癌中已发现许多与肿瘤细胞增殖转移[3]及肿瘤血管新生[4]密切相关的miRNA。MicroRNA-134（miR-134）是近年来新鉴定的出一种miRNA，在包括子宫内膜癌[5]及乳腺癌[6]在内的多种女性生殖系统肿瘤中表达下调，但其在宫颈癌中的表达及生物学意义尚未可知。

本课题拟通过检测miR-134 在宫颈癌中的表达情况，探究上调miR-134 基因表达在体外对宫颈癌细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡水平的影响，旨在为研究miR-134 在宫颈癌发生、发展中的作用提供一定的实验依据。

1 资料与方法

1.1 组织标本

选取2014年1月—2016年12月于西南医科大学附属医院妇产科收治并行手术切除的50 例宫颈癌组织及对应癌旁组织（距肿瘤边缘距离＞2 cm）标本。所有标本于离体0.5 h 内取材，于液氮中固定保存。

1.2 细胞来源及主要试剂

HeLa 细胞由超声科实验室保存，miR-134 慢病毒及阴性对照慢病毒均购自广州复能基因公司，miR-134 及U6 引物购自广州锐博生物科技有限公司，DMEM 培养基及胎牛血清均购自美国Gibco 公司，Trizol 试剂、RT-PCR 试剂盒（Super Script ® One-Step RT-PCR System with Platinum×Taq DNA Polymerase,10928042）及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit,F415L）均购自美国Invitrogen 公司，细胞周期检测试剂盒（KGA512）购自南京凯基生物，Annexin-V/PI 凋亡检测试剂盒（FITC/PI 双染法，E606336）购自生工生物工程（上海）有限公司，兔抗人CCND1 多克隆抗体（AB134175）、β-actin 单克隆抗体（AB8226）均购自美国Abcam 公司。

1.3 qRT-PCR 检测miR-134 及CCND1 mRNA表达

通过Trizol 试剂提取标本及细胞RNA，配制逆转录及PCR 扩增体系。设置逆转录条件：50℃逆转录30 min，94℃灭活2 min，循环次数1；94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循环次数40；72℃最终延伸10 min。通过2-△△Ct法计算miR-134 及CCND1 mRNA 的相对含量。

1.4 细胞培养及慢病毒转导

在适宜条件下培养HeLa 细胞至稳定传代，将HeLa 细胞过夜生长至融合度达70%密度接种6 孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，1×磷酸盐缓冲液充分洗涤细胞。慢病毒感染分组：miR-134组每孔加入1 ml 的miR-134 慢病毒上清液、2 ml 完全培养基及15 μg 聚凝胺；对照组（miR-con 组）每孔加入1 ml 的阴性对照慢病毒上清液、2 ml 完全培养基及15 μg 聚凝胺。转染48 h 后，使用含2 μg/ml 嘌呤霉素的完全培养液筛选稳定转染细胞株。

1.5 平板克隆形成试验

基因重组HeLa 细胞按500 个/孔均匀接种于6 孔板中，每周更换完全培养基2 次。培养2 周后，使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，1%结晶紫染色15 min，置于蒸馏水中洗去多余染液。风干后将6 孔板置于网格纸上计数每孔克隆形成数量，计算克隆形成率。每个样本独立重复实验3 次。

1.6 流式细胞仪分析HeLa 细胞凋亡

HeLa 细胞用预冷PBS 工作液冲洗2 次，胰酶消化细胞后用1 500 r/min 离心5 min 沉淀细胞，预制缓冲液调整细胞数为1×106个/ml。将500 μl 细胞悬液与10 μl 碘化丙啶（PI）溶液混合检测细胞周期；与5 μl Annexin V-FITC 及10μl PI 混合检测细胞凋亡。室温遮光反应10 min 后上机测试。

1.7 Western blotting 检测CCND1 蛋白表达

RIPA 试剂提取细胞总蛋白，垂直电泳分离蛋白后70 V 恒压转膜120 min 固定蛋白，5%的牛白蛋白室温封闭1 h；用3%浓度的脱脂奶粉溶液按1 ∶1 000比例稀释CCND1 及β-actin 抗体。在4℃下孵育相应条带过夜。洗去残余一抗后采用1 ∶5 000 稀释的HRP 标记山羊抗兔或抗鼠二抗室温孵育条带1 h。于暗室内ECL 法发光观察蛋白表达。每个样本独立重复实验3 次。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-134 在宫颈癌组织中的表达情况

miR-134 在宫颈癌组织中的表达水平为（0.596± 0.089），而癌旁组织为（1.488±0.113），两者比较差异有统计学意义（t=2.413，P=0.039），宫颈癌组织中miR-134 的表达水平较癌旁组织低。

2.2 miR-134 对HeLa 细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响

miR-134 慢病毒升高HeLa 细胞中miR-134 的表达水平（t=8.031，P=0.000）。过表达miR-134 下调HeLa 细胞的克隆形成能力（t=3.178，P=0.027）（见图1A）。与miR-con 组比较，过表达miR-134 后，miR-134 组HeLa 细胞被阻滞于G1 期（t=3.386，P=0.014）（见图1B），并且细胞凋亡增多（t=4.223，P=0.008）（见图1C）。

2.3 miR-134 对HeLa 细胞中CCND1 表达的影响

miR-con 组HeLa 细胞内CCND1 mRNA及蛋白表达水平分别为（1.00±0.10）及（0.61±0.08），表达miR-134 的HeLa 细胞内CCND1 mRNA 及蛋白表达水平分别为（0.44±0.07）及（0.15±0.03）；与miR-con组比较，过表达miR-134 的HeLa细胞内CCND1 mRNA（t=4.531，P=0.007）及蛋白（t=2.808，P=0.039）水平均降低。见图2。

图1 过表达miR-134 对宫颈癌HeLa 细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

图2 miR-134 对HeLa 细胞内CCND1 表达的影响

3 讨论

miR-134 位于人类染色体14q32 miRNA 集簇域上。生理学研究发现，miR-134 具有调节海马神经元树突棘发育、增强海马记忆和突触可塑性的功能[7]。病理学上，miR-134 具有保护癫痫患者的脑神经元功能而减轻癫痫损害的作用[8]，但其在宫颈癌中的生物学功能尚不完全清楚。

本研究发现，宫颈癌组织中miR-134 的表达水平呈降低趋势。表明miR-134 在宫颈癌中可能是一种抑癌因子。miR-134 能够抑制体外培养HeLa 细胞的增殖，阻滞其细胞周期的进展并促进细胞凋亡的发生。有研究表明，miR-134 在结直肠癌[9]转移及肺癌[10]耐药中也具有调控作用。说明miRNA-134 具有多样性的抗肿瘤作用，值得人们进一步深入研究。

miR 能够通过结合靶基因3'-UTR 区而发挥负向调控作用。通过生物信息学分析发现，细胞周期蛋白CCND1 的mRNA 存在于miR-134 的结合位点，可能是miR-134 的潜在靶点之一。过表达miR-134 在体外的确能下调CCND1 的表达水平。CCND1 是促进细胞从G0/G1 期向G1/S 期转变的主要调控因子[11]。研究指出，CCND1 的异常高表达与宫颈癌的生长密切相关[12]。因此，下调CCND1 的表达可能是miR-134 发挥抗癌细胞生长作用的关键机制之一。