甲氨蝶呤单用和联合米非司酮对假孕家兔输卵管的影响

韦伟 黄灵绣 宋光辉 李百加 邹少晗

异位妊娠是一种常见的妇科疾病。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作为一种抗有丝分裂活性的药物，在异位妊娠早期保守治疗中效果显著。目前对MTX的研究一直偏向于异位妊娠保守治疗疗效和肿瘤化疗后对卵巢、骨髓造血功能的损害上，对输卵管影响的研究较少[1]。米非司酮为孕激素受体（progestrone receptor，PR）拮抗剂，主要通过抑制孕激素的作用改变子宫内膜容受性以及抑制排卵而达到抗早孕和避孕的目的。临床上MTX联合米非司酮应用于异位妊娠的早期保守治疗一直存在争议，其实际效果也有待商榷[2]。本研究从输卵管收缩功能、形态学、雌激素受体（estrogen receptor，ER）及PR角度观察不同剂量MTX单用和联合米非司酮对假孕家兔输卵管的影响，为MTX治疗对后续妊娠的潜在影响提供实验理论基础，并探讨米非司酮治疗异位妊娠的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年雌性日本大耳白兔50只，体重（2.3±0.2）kg，月龄（4±0.3）个月，由浙江省实验动物中心提供。普通实验动物条件下饲养，置于室温25℃，正常的昼夜光照。

1.2 试剂及仪器 人尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）针剂（75IU/支）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）针剂（1 000IU/安瓿）购自丽珠集团丽珠制药厂。MTX针剂（100mg/支）购自江苏恒瑞医药股份有限公司。米非司酮片（25mg/片）购自浙江仙琚制药股份有限公司。兔抗人ER及PR单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术公司。自制Lock缓冲液：18g氯化钠，0.84g氯化钾，48g氯化钙，0.3g碳酸氢钠，2g葡萄糖，用去离子水定容至2 000ml，pH=7.4。张力换能器（规格：0～10g）、微调固定器购自北京新航兴业科贸有限公司。MedLab生物信号采集处理系统（规格：四通道）购自南京美易科技有限公司。HSS-1（B）型恒温浴槽购自成都仪器厂。SCM型双层麦氏浴皿购自北京牧晨玻璃仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 假孕家兔模型制备及给药方法 实验前制作假孕模型[3]，采用随机数字表法将50只家兔分为单用MTX 1mg/kg组、单用MTX 2mg/kg组、MTX 1mg/kg联合米非司酮组、MTX 2mg/kg联合米非司酮组和对照组5组，每组10只，于动情期肌肉注射HMG 50IU/kg，24h后再肌肉注射HCG 100IU/kg。于致假孕后第4天按照各自剂量一次性肌肉注射MTX；MTX联合米非司酮各组另加喂米非司酮片（0.5mg/kg），研碎化水灌胃，早晚各1次，共3d；对照组仅一次性肌肉注射0.9%氯化钠注射液2ml。

1.3.2 输卵管收缩功能检测 用药结束1周后采用空气栓塞法处死假孕家兔，立即剖腹。取一侧输卵管峡部长约1cm。张力换能器由微调固定器固定然后连接MedLab生物信号采集处理系统。输卵管一端连接张力换能器，一端固定于麦氏浴皿底部，加入Lock缓冲液，从底部通入空气，浴皿置于37℃恒温浴槽之中。静息状态下先调零然后通过MedLab系统观察输卵管收缩频率及幅度变化，时间为60min。收缩频率是从收缩记录图上找出每次记录区间内的所有收缩波，单位为次/30min；收缩幅度为每次收缩的最高点与最低点之间的差值，单位为mV。

1.3.3 输卵管常规病理检查 取另一侧输卵管壶腹部用10%甲醛固定，石蜡包埋，常规切片后HE染色，在光镜下观察各组形态学变化。

1.3.4 输卵管壶腹部组织ER、PR表达检测 采用SP免疫组化二步法：切片脱蜡后高压修复，滴加过氧化氢甲醇液阻断，室温孵育，滴加一抗4℃冰箱过夜；复温后滴加二抗，DAB显色至显微镜下出现着色清晰、境界明确的棕黄色阳性产物，冲洗后苏木素复染，PBS冲洗返蓝；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。结果判断：ER、PR定位于细胞核，每张切片在200倍光镜下观察5个视野，阳性细胞表达占30%为（＋），占50%以上为（＋＋＋），两者之间为（＋＋），未见阳性细胞或只有极少数阳性细胞为（-），以PBS代替一抗作为阴性对照。ER、PR表达阳性率=ER、PR表达（＋＋＋）例数/总例数×100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料组间比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物一般情况 假孕家兔模型建立成功，无一只死亡。与对照组相比，所有假孕家兔在MTX、米非司酮处理后的期间内均未观察到明显的异常行为，在实验取材过程中，各组家兔输卵管大体解剖均未发现明显的肉眼改变。

2.2 各组输卵管收缩功能比较 与对照组比较，各用药组输卵管收缩频率均增快，收缩幅度均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；单用MTX两组输卵管收缩频率和收缩幅度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与单用MTX两组比较，联合用药两组输卵管收缩幅度均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1和图1。

表1 各组输卵管收缩功能比较

2.3 各组输卵管壶腹部组织形态学变化 光镜下可见对照组输卵管黏膜纤毛及柱状上皮完整（图2a）；单用MTX 1mg/kg组输卵管黏膜纤毛及间质轻度水肿（图2b）；单用MTX 2mg/kg组输卵管黏膜水肿，可见少量炎性细胞浸润（图2c）；MTX 1mg/kg联合米非司酮组输卵管黏膜纤毛及间质水肿，少量炎性细胞浸润（图2d）；MTX 2mg/kg联合米非司酮组输卵管黏膜纤毛及间质水肿明显，炎性细胞浸及全层，并见少量嗜酸性粒细胞（图2e）。

图1 各组输卵管收缩图形，每一个波为一次收缩活动（a：对照组；b：MTX 1mg/kg 组；c：MTX 1mg/kg 联合米非司酮组；d：MTX 2mg/kg组；e：MTX 2mg/kg联合米非司酮组；收缩幅度以mV表示，每一格为1.2mV）

图2 各组输卵管壶腹部组织形态学变化（a：对照组；b：单用MTX 1mg/kg组；c：单用MTX 2mg/kg组；d：MTX 1mg/kg联合米非司酮组；e：MTX 2mg/kg联合米非司酮组；HE 染色，×100）

2.4 各组输卵管壶腹部组织ER阳性表达率比较MTX 2mg/kg联合米非司酮组较对照组ER阳性表达率下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各用药组与对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。各用药组之间ER阳性表达率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2和图 3（插页）。

2.5 各组输卵管壶腹部组织PR阳性表达率比较MTX 2mg/kg联合米非司酮组较对照组PR阳性表达率下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各用药组与对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。各用药组之间PR阳性表达率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 3和图 4（插页）。

表2 各组输卵管壶腹部组织ER阳性表达率比较（只）

3 讨论

输卵管由外向内一共分3层：浆膜层，平滑肌层（外层为纵肌层、内层为环肌层），黏膜层。输卵管黏膜上皮为单层柱状上皮，主要包含了纤毛上皮细胞和无纤毛上皮细胞，两者的比例以及两种细胞的高度与雌孕激素水平有关。雌孕激素及肾上腺素的多重调节引起输卵管内层平滑肌蠕动以及外层平滑肌纵向运动，两者的协同作用引起黏膜层纤毛上皮细胞规律摆动，从而起到输送受精卵的目的[4]。本实验因没有理想的异位妊娠动物模型，故采用假孕家兔的输卵管作为研究模型，同时采用的药物剂量与临床治疗剂量基本相符，因而也能取得较好的一致性。

表3 各组输卵管壶腹部组织PR阳性表达率比较（只）

图3 各组输卵管壶腹部组织ER阳性表达情况[a：ER阴性表达（-）；b：ER 阳性表达（+）；c：ER 阳性表达（++）；d：ER 阳性表达（+++）；免疫组化染色，×200]

图4 各组输卵管壶腹部组织PR阳性表达情况[a：PR阴性表达（-）；b：PR 阳性表达（+）；c：PR 阳性表达（++）；d：PR 阳性表达（+++）；免疫组化染色，×200]

MTX为叶酸类似物，通过抑制二氢叶酸还原成四氢叶酸，减少一碳单位形成，从而抑制DNA的合成和细胞能量代谢。临床常用于异位妊娠的保守治疗和肿瘤的化疗。MTX治疗对卵巢及骨髓造血功能的损害已有深入研究，但对后续妊娠的潜在影响尤其对输卵管的影响研究甚少。有学者研究认为MTX会导致线粒体溶解，胞质空泡形成，纤毛的倒伏断裂，这在一定程度上可导致不孕不育和异位妊娠[5-6]。低剂量下这种损伤在一定时间内可以部分恢复，若剂量＞5mg/kg，这种损伤则无法恢复[7]。本研究发现，注射MTX后输卵管收缩频率加快，收缩幅度下降，而剂量由1mg/kg增加至2mg/kg后输卵管收缩活动并没有产生明显变化。这可能与MTX影响DNA、RNA的合成从而影响蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白）的生成；损伤细胞诱发前列腺素释放以及炎症反应促白三烯和前列腺素的合成从而刺激输卵管收缩频率而抑制收缩活动有关[8-9]。另外MTX在低剂量（1mg/kg）时就会导致黏膜纤毛及间质水肿，炎性细胞浸润，这种改变同MTX的剂量呈相关性。在观察MTX对输卵管壶腹部组织ER、PR阳性表达的影响时，笔者发现MTX 1mg/kg组、MTX 2mg/kg组和MTX 1mg/kg联合米非司酮与对照组ER及PR阳性表达率比较差异均无统计学意义，这与本试验最初的设想以及其他学者的研究略有出入，可能与样本量过少有关。

米非司酮为PR拮抗剂，可竞争性结合PR和肾上腺素受体，通过拮抗孕激素改变子宫内膜容受性和抑制排卵达到抗早孕及避孕的目的。目前对米非司酮的研究偏向于抗孕激素治疗，如治疗子宫腺肌症、子宫肌瘤等，而对输卵管本身的影响研究较少[10]。王莉芬等[11]报道米非司酮在转录和翻译水平抑制PR的合成，下调ER含量，在增生期和分泌期输卵管ER、PR表达率相对较高，妊娠期较非妊娠期表达明显下降。与子宫内膜相比，输卵管部位ER、PR表达更低[12-13]。本研究发现MTX剂量一定的情况下添加米非司酮后较单用MTX输卵管收缩频率无变化，但收缩幅度下降，并且可在组织学水平加重MTX对输卵管组织的损伤。此外与对照组比较，MTX 2mg/kg联合米非司酮组ER、PR阳性表达率明显降低，而MTX 1mg/kg联合米非司酮组与对照组ER、PR阳性表达率比较差异均无统计学意义。由此提示MTX达到一定剂量（2mg/kg）时，其联合米非司酮的确可以下调ER、PR的表达。

综上所述，MTX可以对输卵管的活动产生一定的抑制作用，并可以对输卵管组织学造成一定损伤，且这种损伤与剂量呈相关性，而米非司酮可以增强MTX的上述作用。当MTX达到一定剂量时，其联合米非司酮会对输卵管ER、PR的表达起到抑制作用，在较低剂量（1mg/kg）时，这种作用不明显。因而在临床使用MTX治疗异位妊娠或行肿瘤化疗时应尽可能减少剂量，因其可能会增加后续异位妊娠或不孕症的发生概率。米非司酮在治疗异位妊娠时，不但增加了MTX对输卵管的损伤及抑制，而且在输卵管部位抗孕激素、抗早孕的作用弱，增加了内出血的风险，因而其辅助治疗异位妊娠的理论依据不够充分，需慎重使用。