低氧环境对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

陈思翔 赵凡 叶妙勇 朱晨锋 赵剑锋 黄晓军

阴茎海绵体内氧含量与勃起功能有着密不可分的联系。目前研究认为，低氧是勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）的一个独立危险因子[1]。根治性盆腔手术（如根治性前列腺切除术）后患者常常会发生神经性ED，而低氧与其生理、病理变化有关[2]。有研究发现，因根治性前列腺切除术所致的ED，最主要的发病原因是海绵体神经（cavernous nerve，CN）损伤后，患者夜间生理性勃起受到影响，海绵体内组织缺氧，从而导致阴茎海绵体平滑肌细胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）损伤和海绵体纤维化[3-4]。动物实验发现，SD大鼠双侧海绵体神经切除后，CCSMC中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）表达升高，CCSMC发生了缺氧和表型转化[5]。一些有关ED发生机制的研究提示，MAPK信号通路在其中有着举足轻重的地位[6]。但是，低氧状态下CCSMC发生表型转化与MAPK信号通路之间是否存在联系，目前尚未可知。本研究通过低氧干预CCSMC，观察低氧状态下大鼠CCSMC表型转化及MAPK信号通路相关蛋白表达的变化，以探讨低氧环境对大鼠CCSMC表型转化及MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠1只，6周龄，体质量170g。由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 主要试剂 DMED/F-12高糖培养液、FBS（美国Gibco公司），胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ（美国Sigma公司），4%多聚甲醛、Trtion X-100、异硫氰酸荧光素（SABCFITC）标记的羊抗小鼠IgG和辣根过氧化物酶（HRP）（武汉博士德生物工程有限公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白定量试剂盒（杭州碧云天公司），兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、兔抗肌间线蛋白（Desmin）、兔抗 β-Actin（杭州华安生物技术有限公司），兔抗CollagenⅠ（美国Immunoway公司），兔抗细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）及兔抗p-ERK1/2、兔抗p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及兔抗p-p38 MAPK、兔抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）及兔抗p-JNK（美国Cell Signaling Technology公司），混合气体1%O2＋5%CO2＋94%N2（杭州今工物资有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 CCSMC培养 采用酶消化法培养细胞[7]。采取颈椎脱臼法将SD大鼠迅速处死，置入75%乙醇中浸泡5min，转移至无菌超净台中，迅速切取阴茎于无菌培养皿中，用4℃预冷的PBS冲洗阴茎组织2次。在PBS中去除龟头部分，仔细剥除阴茎外周皮肤、白膜以及尿道海绵体、海绵体间隔和血管。PBS漂洗3次，剪成1mm×1mm×1mm的体积均匀的组织块，然后放入含0.5%胶原酶Ⅰ溶液的1.5ml离心管中，置于37°C恒温培养箱3～4h，使组织块基本消化完毕。1 000r/min离心5min，弃上清液，在沉淀中加入1ml已配制好的含20%FBS的DMEM/F12高糖培养液，吹打均匀，移至细胞培养瓶，置于37°C、5%CO2培养箱中。培养24h后，镜下可见贴壁生长的平滑肌细胞。当细胞生长融合达70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，然后换含10%FBS的DMEM/F12高糖细胞培养液培养。用于实验的细胞均在4代以内。

1.3.2 CCSMC鉴定 采用免疫荧光法鉴定CCSMC[8-9]。按2×104/ml浓度将CCSMC铺于24孔板中（24孔板中预先放入无菌圆型盖玻片），置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h，弃培养液，PBS洗3次，10min/次；加入4%多聚甲醛，4℃固定 15min，PBS 洗 3 次，10min/次；用0.5%Trtion X-100室温破膜处理15min，PBS洗3次，10min/次；血清封闭液室温封闭1h，分别加入兔抗α-SMA（1∶200）和兔抗 Desmin（1∶200）4℃过夜；PBS 洗 3次，10min/次，生物素化二抗（1∶100）置于 37℃恒温培养箱避光孵育30min；PBS洗3次，10min/次，加入SABCFITC（1∶100）室温避光孵育 2h；PBS 洗 3 次，10min/次，加入 DAPI（0.5μg/ml）室温避光孵育 15min；PBS 洗 3次，10min/次，取出盖玻片置于载玻片上，并用抗荧光衰减封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

1.3.3 细胞低氧处理 参照Wu等[10]提出的方法进行细胞低氧处理。按3×104/ml浓度将CCSMC铺在6孔板中；待第2天细胞贴壁生长良好后换液；低氧组放入缺氧小室，通入混合气体（1%O2＋5%CO2＋94%N2）；再将缺氧小室放入37℃恒温培养箱中，低氧培养48h。同时常氧组置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。

1.3.4 CCSMC表型转化及MAPK信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blot法。收集1.3.3培养的细胞，加入RIPA裂解液（含PMSF 1mmol/L），于冰上裂解30min，12 000r/min离心15min，取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃金属浴变性15min，用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白（80V，30min；120V，90min），然后切下含有目的蛋白条带的凝胶条，采用湿转法转至PVDF膜上（分子质量较小：200mA，120min；分子质量较大：200mA，150min）。用 5%脱脂奶粉于摇床上室温封闭2h，TBST摇床洗膜3次，10min/次；分别加入兔抗 α-SMA（1∶1 000）、兔抗 CollagenⅠ（1∶1 000）、兔抗 ERK1/2（1∶1 000）及兔抗 p-ERK1/2（1∶1 000）、兔抗 p38 MAPK（1∶1 000）及兔抗 p-p38 MAPK（1∶1 000）、兔抗 JNK（1∶1 000）及兔抗 p-JNK（1∶1 000）和鼠抗 β-actin（1∶1 000），4℃摇床孵育过夜。TBST 摇床洗膜3次，10min/次；分别对应加入兔抗和鼠抗二抗（1∶15 000），摇床室温避光孵育2h，TBST摇床洗膜3次，10min/次。采用Odyssey双色红外激光成像系统扫描，用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析。所有实验重复3次，以β-actin作为内参，计算HIF-1α、CollagenⅠ、α-SMA蛋白相对表达量；以β-actin为内参，计算 p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值，即p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 应用SPSS 23.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCSMC鉴定结果 细胞分离培养第2天在显微镜下观察到细胞贴壁生长良好，多数呈长梭形。选取4代内细胞进行免疫荧光鉴定，在荧光显微镜下观察抗α-SMA和抗Desmin免疫荧光均为阳性，细胞核DAPI染色为蓝色。将图1中a与b融合得到c，d与e融合得到f，可观察到大部分细胞，且细胞核与细胞质重合在一起，由此证明分离培养的细胞是同种细胞，即CCSMC。

图1 CCSMC的免疫荧光鉴定（a：采用抗α-SMA免疫荧光染色；b：使用DAPI进行细胞核染色；c：a与b融合得到；d：采用抗Desmin免疫荧光染色；e：使用DAPI进行细胞核染色；f：d与e融合得到；免疫荧光，×100）

2.2 低氧干预48h后CCSMC的形态学变化 常氧条件下培养的CCSMC多呈长梭形，见图2a；而经低氧干预48h后，CCSMC形态发生变化，主要表现为胞体趋向肥大，见图2b。

图2 常氧与低氧干预48h后CCSMC形态学观察（a：常氧条件下；b：低氧条件下；倒置显微镜，×100）

2.3 低氧状态下CCSMC表型转化相关蛋白表达的变化 经低氧干预48h后，HIF-1α、CollagenⅠ蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.49±0.07，较常氧组的0.12±0.01、0.29±0.04均明显升高（均P＜0.05）；α-SMA 蛋白相对表达量为0.35±0.04，较常氧组的0.47±0.02明显降低（P＜0.05），见图 3。

2.4 低氧状态下CCSMC MAPK信号通路相关蛋白表达的变化 经低氧干预48h后，p-JNK、p-p38 MAPK蛋白相对表达量分别为 0.27±0.05、0.38±0.28，较常氧组的0.42±0.09、0.58±0.27 均明显降低（均P＜0.05）；p-ERK蛋白相对表达量为0.74±0.25，与常氧组的0.74±0.23比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

3 讨论

CN损伤后会影响男性夜间生理性勃起，从而引起CCSMC损伤和海绵体纤维化；在这过程中，缺氧是关键[3-4]。相关研究表明，慢性缺氧性疾病，如动脉粥样硬化、睡眠呼吸暂停综合征、慢性阻塞性肺病等，可造成不同程度的夜间生理性勃起损害[11-13]。表型转化，源自血管平滑肌细胞研究领域的概念，多次被用于阐述CCSMC表型转化与ED关系的类推证据[14-16]。目前，国内外多个团队正围绕表型转化与ED的关系展开一系列研究，国内以吕伯东团队、韦安阳团队为主。吕伯东团队通过低氧干预CCSMC不同时间来观察CCSMC发生表型转化的变化规律，最终认为低氧干预48h是诱导CCSMC发生表型转化最显著的时间[17]。同时，吕伯东团队还发现低氧干预48h后，低氧组表型转化相关蛋白α-SMA表达较常氧组明显下降，CollagenⅠ表达较常氧组明显升高[18]。参考吕伯东团队的前期实验研究成果，本研究将CCSMC置于低氧中培养48h，结果发现低氧组α-SMA表达较常氧组明显下降，HIF-1α、CollagenⅠ表达均明显升高，这说明低氧干预能使CCSMC发生表型转化，与吕伯东团队的研究结果一致。

MAPK信号通路能调控细胞的各种基本生命活动，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等。ERK1/2、JNK和p38（α、β、γ和δ）是MAPK家族的成员，与不同类型ED的生理、病理改变有着联系[6]。Labazi等[19]在高血压ED大鼠模型中发现二甲双胍可以下调阴茎海绵体中p-ERK1/2水平。Lysiak等[20]通过损伤（完全切断）和夹损伤（非完全切断）小鼠阴茎CN，结果发现阴茎海绵体出现细胞凋亡，且伴有p-JNK、p-p38 MAPK水平升高。Abdel等[21]运用实时PCR法检测糖尿病型ED大鼠的基因表达，结果发现p38基因表达明显升高。本实验结果显示，原代培养的SD大鼠CCSMC在低氧处理48h后发生了表型转化，同时p-ERK表达无明显变化，p-JNK、p-p38 MAPK表达均明显下降。

综上所述，低氧诱导CCSMC发生表型转化的同时，伴随JNK、p38 MAPK信号的改变，但关于JNK及p38 MAPK信号在低氧所致CCSMC表型转化过程中的具体调控作用尚不清楚。因此，笔者下一步将以p-JNK、p-p38 MAPK表达下调与低氧所致CCSMC表型转化之间的相关性展开深入的研究，为临床上治疗神经性ED提供新思路。