肾母细胞瘤1基因及其启动子甲基化在多发性骨髓瘤患者中的表达及其与病程的关联研究

鲁崇高

(巩义市人民医院骨科，河南 巩义 451200)

多发性骨髓瘤是以骨髓中浆细胞克隆性增殖为主要病理改变的浆细胞恶性肿瘤，同时浆细胞在疾病进展过程中会分泌单克隆免疫球蛋白或轻链[1]。多发性骨髓瘤属于常见的血液系统恶性肿瘤，中老年人群高发,临床上主要可见骨痛、贫血、高钙血症、肾损伤以及反复感染等临床症状[2]。肾母细胞瘤1(WT1)基因最早在Wilms'瘤中被发现，位于11号染色体短臂，与泌尿生殖系统的生理和病理变化关联密切；近年来有研究发现该基因参与了造血功能的相关调控，与白血病等血液系统疾病的形成有关,并且同多种造血因子存在相互作用,与造血细胞的增殖、分化以及凋亡过程关联密切。该基因的表达以及其启动子甲基化同血液系统疾病存在关联，多发性骨髓瘤中可见WT1基因的表达减低，但相关表观遗传学研究尚不多[3]。本研究拟就WT1基因及其启动子甲基化在多发性骨髓瘤中的表达意义以及与病程的关联进行分析讨论。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取本院就诊的确诊多发性骨髓瘤患者43例(观察组)进行研究，同时选取性别、年龄具有可比性的同期健康对照者20例作为对照组。观察组43例患者中，男性患者23例的年龄38～69(56.85±8.43)岁，女性患者20例的年龄36～69(55.34±8.99)岁。收集受试对象基本信息以及病程资料，同时对骨髓WT1的mRNA表达水平以及其基因启动子区甲基化阳性情况进行统计分析，就WT1基因及其启动子甲基化在多发性骨髓瘤中的表达意义及其与病程的关联进行讨论。43例多发性骨髓瘤患者中，病程≤0.5 a者18例，>0.5～<3 a者14例，≥3 a者11例。免疫球蛋白类型IgG型17例,IgA型11例,轻链型11例，未分泌型4例。按照Durie-Salmon分期诊断标准，Ⅰ期6例，Ⅱ期30例,Ⅲ期7例。男性、女性患者在年龄分布、分型及病情分期方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。观察组患者纳入标准：确诊的多发性骨髓瘤的患者，年龄18岁及以上，病历资料完整且知情同意，能配合本研究；排除标准：排除患有其他血液系统疾病的患者以及其他恶性肿瘤患者，排除18岁以下患者及各种原因导致不能配合本研究者。本研究已通过本院医学伦理委员会审核。

1.2 研究方法应用聚合酶链反应(PCR)测定并分析WT1的mRNA表达以及基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化水平,进而讨论患者病程与WT1基因表达的相互关系。PCR使用上海生工生物工程技术服务公司提供的试剂盒，引物合成也由该公司完成，总RNA提取Trizol购自美国Invitrogen公司，提取总RNA后进行逆转录PCR，使用甲基化特异性PCR检测WT1基因启动子DNA的甲基化状态;并对病程≤0.5、>0.5～<3、≥3 a的患者WT1 mRNA表达水平以及其启动子区域甲基化状态进行比较分析。

2 结果

2.1 不同患者WT1 mRNA表达水平比较及其与病程的关联所有多发性骨髓瘤患者WT1 mRNA总体表达水平为0.55±0.08，低于对照组的0.60±0.07，差异均有统计学意义(P均< 0.05)；其中男性患者表达水平为0.54±0.08，低于对照组，差异均有统计学意义(P均< 0.05)；女性患者表达水平为0.57±0.08，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同病程患者WT1 mRNA表达水平与性别无关(P>0.05)。男性、女性患者不同病程的WT1 mRNA表达水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；且与对照组比较差异均有统计学意义(P均< 0.05)。所有多发性骨髓瘤患者病程≤0.5 a和>0.5～<3 a的WT1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；但均高于≥3 a患者，差异均有统计学意义(P均< 0.05)；不同病程的WT1 mRNA表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(P均< 0.05)。见表1。

表1 不同患者WT1 mRNA表达水平比较及其与病程的关联

2.2 不同患者WT1甲基化水平比较及其与病程的关联男性患者WT1启动子甲基化水平为196 814±9 700，女性为196 015±8 906，所有多发性骨髓瘤患者总体水平为196 528±9 125，均高于对照组的3 528±825，差异均有统计学意义(P均< 0.05)。男性、女性、所有多发性骨髓瘤患者不同病程的WT1启动子甲基化水平比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；且均高于对照组患者,差异均有统计学意义(P均<0.05)。不同病程的男性、女性、所有患者WT1启动子甲基化水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 不同患者WT1启动子甲基化水平比较其与病程的关联

2.3 多发性骨髓瘤患者WT1 mRNA及其启动子甲基化与病程的关联性分析多发性骨髓瘤患者WT1 mRNA表达增高与病程延长呈负相关(r=-0.101,P<0.05)，其中男性患者WT1 mRNA表达增高与病程延长呈负相关(r=-0.090,P<0.05)，女性患者WT1 mRNA表达增高与病程延长呈负相关(r=-0.180,P>0.05)。WT1启动子甲基化增高与病程病程延长呈正相关(r=0.150,P<0.05)；男性和女性患者中启动子甲基化水平增高与病程延长也均呈正相关(r=0.181,P<0.05；r=0.120,P<0.05)。

3 讨论

多发性骨髓瘤作为一种恶性浆细胞病，目前WHO将其归为B细胞淋巴瘤的一种。多发性骨髓瘤的主要病理特征就是骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链，也就是M蛋白的过度生成，其中极少数患者是不产生M蛋白的未分泌型患者。统计数字提示其发病率为2～3/10万，男性略高于女性，患者多为中老年人[4]。

国内研究[5]已经提示表观遗传学改变对血液系统肿瘤也起到重要作用，多发性骨髓瘤也是如此。有研究[6]提示，在多发性骨髓瘤中也可见WT1基因表达的减低，不同病程的患者之间WT1 mRNA表达情况存在差别，且分别分析男性和女性中的情况也可见差别，均以病程≥3 a患者表达水平最低，男性和女性中分别进行不同病程患者之间的两两比较差异均有统计学意义，合计统计时病程>0.5～<3 a患者以及病程≤0.5 a患者之间未见显著差异。表观遗传学的改变在不改变原有序列的情况下影响染色质的结构或基因的正常表达,使基因发生可遗传的功能改变[7]。一些血液系统的肿瘤中，WT1启动子基因启动子区域的甲基化模式会发生改变，在部分血液肿瘤细胞系中可见WT1基因表达水平的减低，在基因启动子区域可见甲基化的增高；多发性骨髓瘤的DNA甲基化相关研究尚不多[8]，本研究中男性患者WT1启动子甲基化水平为196 814±9 700，女性为196 015±8 906，总体水平为196 528±9 125，未见性别差异，且均高于对照组。与对照组相比，病程<3 a者WT1 mRNA表达水平较正常人表达明显增高，而病程≥3 a患者表达水平较低，提示随着病程延长，WT1 mRNA表达减低的情况也逐渐严重，但病程<3 a者WT1 mRNA表达水平较正常人表达明显增高可能与本研究样本量较小等情况有关，其内在原因有待今后深入研究。此外，深入分析发现，不同病程患者的WT1启动子甲基化水平差异有统计学意义, 病程短的患者表达水平低，病程长的患者表达水平高，男性、女性患者中也均如此；且进一步两两比较中也均可见差异。提示患者WT1启动子甲基化水平与病程存在关联。本研究提示多发性骨髓瘤患者存在WT1 mRNA表达较正常人低的情况，女性中不明显；同时病程越长，患者WT1 mRNA表达水平越低，而启动子甲基化水平越高，启动子甲基化水平等表观遗传学指标的变化体现了环境等因素的影响，其中也不乏有治疗因素的作用，但与具体治疗方案之间的相互关联有待进一步研究。

综上所述，WT1基因及其启动子甲基化状态在多发性骨髓瘤进展过程中发挥了一定的作用。