寿胎丸对GnRHa控制性超促排卵着床期小鼠子宫内膜形态及妊娠结局的影响

谭福红，李 楠，张 辉，陈 梅

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院妇科，陕西 咸阳 712000）

控制性超促排卵(COH)是IVF-ET最常用的治疗方案[1]。其优点是提高卵母细胞质量、同步卵泡发育、募集更多成熟卵泡、防止早期LH峰值和降低周期取消率等[2]。但研究表明，COH可以影响子宫内膜的形态和感受性[3]。寿胎丸作为补肾安胎的基础方，出自清末明初著名医家张锡纯的《医学衷中参西录》。原方由菟丝子、续断、桑寄生、阿胶四味药物组成，张娟[4]等对2010～2015年有关与寿胎丸的文献进行检索，发现其在妇科疾病治疗方面有着广泛的影响，除流产、月经不调、多囊卵巢综合征等方面外，也包含了辅助生殖技术。在药理及毒理学研究中发现寿胎丸对妊娠期孕鼠生殖功能状态未见明显影响，未见鼠胎仔致畸形作用[5]。因此本文通过寿胎丸对控制性超促排卵着床期小鼠子宫内膜形态及厚度的实验研究，为寿胎丸在辅助生殖技术治疗方面提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物

成熟未孕雌性ICR系SPF小鼠，6～8周龄，体重30±5g，清洁级：6～8周龄性成熟雄鼠体重30±5g，均由成都达硕实验动物中心提供，合格证号：SCXK（川）2015-030。室温（20±2）℃，动物自由摄食、饮水，普通饲料喂养。

1.1.2 药物

注射用醋酸亮丙瑞林微球（国药准字H20093852）、注射用尿促性素（HMG）（国药准字H10940097）、注射用绒促性素（HCG）（国药准字H44020674），均购自上海丽珠制药有限公司。寿胎丸组方菟丝子120 g，桑寄生60 g，续断60 g，阿胶60 g，均购自陕西中医药大学附属医院药剂科，自来水浸泡30 min，根据小鼠等效计量相当于人用剂量的9.1倍计算，煎煮浓缩药物终浓度为1g生药/ml混悬液，4℃冰箱保存。

1.1.3 主要试剂及仪器

苏木素-伊红（HE）染色液购自碧云天生物技术公司；4%多聚甲醛、无水乙醇、1%盐酸分化液、二甲苯、枸橼酸缓冲盐溶液（PBS）、光学显微镜（XSZ-81，广西梧州市光学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药方法

将60只雌性小鼠适应性喂养3天后，按照随机数字分为空白组、模型组、中药组，每组20只。每日进行阴道涂片，连续观察2个动情周期，将具有规律动情周期的小鼠纳入本实验研究。从第3个动情周期开始实验。小鼠动情周期为4-5天，分为:动情前期（P）、动情期（E）、动情后期（M）、动情间期（DI），于动情前期参照文献[6]进行用药。用药剂量参照小鼠等效剂量相当于人用剂量的9.1倍，计算小鼠灌胃剂量。

造模前，空白组、模型组按照1ml/100g灌服生理盐水，1次/d，中药组按照1ml/100g灌服中药，1次/d。

造模开始，模型组及中药组每日上午9时腹腔注射醋酸亮丙瑞林，剂量为1.5μg/100g体重，连续10天；第10天同时注射HMG，剂量为1IU/100g；造模第12天上午9：00腹腔注射HCG，剂量为10IU/100g。

造模结束当日18：00按雌雄比例2:1合笼，合笼后D4天，3组各处死10只观察妊娠数并取子宫观察内膜厚度和形态学变化。剩余小鼠于D7处死，观察各组的总妊娠率。

1.2.2 HE染色观察着床窗口期子宫内膜形态学变化

小鼠断颈处死，剖取小鼠子宫，放置于4%多聚甲醛中固定24h。将脱水包埋后的组织用切片机，切成3 um，展片后捞片烘干、脱蜡，依次按照二甲苯①15 min→二甲苯② 15 min→100%乙醇3 min→90%乙醇3min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→自来水冲洗3 min→蒸馏水浸泡6 min后开始HE染色。擦干蒸馏水，苏木素染色10 min→1%盐酸分化液10s，流水冲洗15 min→蒸馏水冲洗3s，伊红染色1 min，依次按照75%、85%、95%、100%乙醇脱水各3 min，二甲苯①5 min→二甲苯②3 min，擦干二甲苯后中性树脂封片。待中性树脂干燥后显微镜下观察子宫内膜形体学变化。显微镜下观察着床窗口期子宫内膜厚度及腺体的周长、面积和最大直径。测量采用Lecia Qwin Plus 图像处理软件进行处理。

1.2.3 妊娠率的计算

合笼后D4、D7各组处死10只小鼠，摘取子宫，记录孕鼠数。生理盐水冲洗子宫，体式显微镜下观察是否有胚胎，检见胚胎者视为孕鼠，无胚胎者视为未孕。妊娠率（%）=（孕鼠数/交配雌鼠数）×100%。

1.2.4 统计方法

2 结 果

2.1 3组小鼠着床窗口期子宫内膜厚度及形态学的变化

由表1可以看出，合笼后D4空白组与模型组比较差异有统计学意义（P＞0.05），模型组子宫内膜厚度变薄，腺体周长、面积和最大直径均小于中药组（P＜0.05）。镜下观察到空白组小鼠子宫内膜腺体丰富、腺腔分泌充分、间质疏松。模型组子宫内膜腺体数量较少、腺腔直径较小且分泌不足、间质水肿，内膜与间质发育不同步。中药组子宫内膜发育较模型组成熟，腺体数目、腺腔直径及分泌程度、间质疏松接近空白组。（图1）

表1 3组小鼠着床窗口期子宫内膜厚度及形态学的比较（x±s）

图1 3组小鼠着床窗口期子宫内膜形态学变化（HE×200）

2.2 3组小鼠总妊娠率的比较

模型组的总妊娠率与对照组和中药组相比较，存在显著性差异（P＜0.05）。空白组与模型组之间的总妊娠率存在显著性差异（P＞0.05）。

表2 3组小鼠妊娠率的比较

3 讨 论

控制性超促排卵是IVF-ET中最常见的治疗方案，归纳为：单用克罗米芬、单纯促排卵（HMG+HCG）和GnRHa+HMG+HCG，根据马永臻[7]的临床试验研究，认为三者相比较而言，GnRHa+HMG+HCG方案对子宫内膜的影响最小，内膜与间质的同步性较其它两种一致性最好，着床率较高。马艳华[8]对控制性超促排卵对子宫内膜的影响情况进行综述，归纳为三个方面，包括子宫内膜组织学改变、超微结构胞饮突表达异常、子宫内膜激素受体表达异常等，其中子宫内膜组织学包括组织分日与生理不符、腺体发育与间质发育不同步性，而这一研究最为直观的反应COH对子宫内膜的影响，因此本实验采用GnRHa+HMG+HCG作为COH方案，将子宫内膜形态变化、厚度作为检测指标。

近年来利用现代科学研究，关于寿胎丸的研究十分广泛[9-15]，关于生殖医学方面，各研究均认为寿胎丸加减可以改善COH后大/小鼠子宫内膜的容受性。本研究观察了寿胎丸基础方对GnRHa控制性超促排着床期子宫内膜的厚度及形态学的改变，结果显示经寿胎丸治疗后，着床期子宫内膜厚度较模型组明显增加，受抑制的内膜得到了逆转。形态学上子宫内膜腺体数量丰富、腺腔增大、腺腔分泌充分，间质轻度疏松，内膜与腺体的发育基本同步。从最终各组的总妊娠率中也证实了中药干预后的效果，中药组的妊娠率高于模型组，表明寿胎丸对胚胎的粘附和植入过程中子宫内膜局部微环境有正向调节作用。这一研究对今后临床用药起到了指导作用。