北京地区草莓炭疽病病原鉴定及生物防治药剂筛选

王步云，乔 岩，张 涛，郑书恒，赵 磊，万 敏，李恒羽，王吐虹

(1.北京市植物保护站，北京 100029； 2.CABI东亚中心，北京 100081；3.中国农业大学 植物保护学院，北京 100193)

草莓炭疽病是全世界草莓产区的重要病害，在草莓整个生育期都可以发生危害[1]。近年来，因复种年限延长、种植品种单一、感病品种种植面积扩大，炭疽病病原积累增多，加之设施密闭及高温高湿环境，导致草莓炭疽病已上升为草莓苗期的主要病害[2-3]，尤其是在草莓连作地，给草莓生产带来了严重障碍，可造成草莓减产25%～30%，严重时甚至可造成整棚死苗，极大地影响草莓的产量和品质[4-5]。

国外关于草莓炭疽病病原菌的报道有很多。MASS[6]的研究认为，草莓炭疽病由尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黑线炭疽菌(C.dematium)和草莓炭疽菌(C.fragariae)等4种病原菌引起，但是目前被普遍认可的是，C.acutatum、C.gloeosporioides、C.fragariae等3种病原菌可引起草莓炭疽病[7]。我国关于草莓炭疽病病原菌的研究相对较少。任小杰等[8]的研究表明，上海市草莓炭疽病病原菌的主要种类是C.acutatum和C.gloeosporioides。万瑶[9]通过研究发现，上海、浙江建德和浙江杭州草莓主要产区的草莓炭疽病病原菌主要为C.acutatum、C.gloeosporioides和C.fragariae。张海英等[10]的研究表明，辽宁抚顺市草莓炭疽病的病原菌主要是C.gloeosporioides。杨敬辉等[11]对江苏句容的草莓炭疽病样品进行检测，结果表明，病原为围小丛壳菌(Glmoerellacingulata)。

由于草莓果实属浆果，是鲜食水果，果实一般直接入口，因此对农药残留要求严格。目前生产上主要使用多菌灵、苯醚甲酰胺等化学农药防治草莓炭疽病，但由于多年连续使用，导致病菌对一些药剂产生抗性，不仅防治效果不够理想，且易造成农药残留[4]。因此，筛选高效、安全的生物药剂并提供合理安全的用药技术，不仅可以对草莓种植户在采摘期的用药进行科学有效指导，而且可以有效保障草莓生产和食用安全。

本研究通过采集北京多个草莓种植区的草莓炭疽病样本，对病原菌进行分离、镜检、纯化培养及形态学观察，初步明确北京地区草莓炭疽病病原菌的主要类型；同时，为了筛选防治草莓炭疽病的高效药剂，选择5种不同的生物药剂进行田间药效试验，以期为草莓炭疽病的防治提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试作物：草莓品种为红颜。

供试培养基：PD、PDA、PSA培养基配方参考方中达《植病研究方法》[12]。

供试药剂：所用生物药剂5种，见表1。

表1 供试药剂及使用剂量

主要设备：WS-16手动喷雾器购自山东卫士植保机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 草莓炭疽病病原鉴定

1.2.1.1 样本采集 2017年4月—2018年3月，选择北京草莓产区昌平区兴寿镇、崔村镇，平谷区山东村镇、马坊镇，大兴区黄村镇、庞各庄镇的草莓种植基地，于定植期和开花结果期2个时间段采集草莓炭疽病的发病植株，每个镇20个样本，共抽取样本120个，对叶片、叶柄和匍匐茎采用常规病组织分离方法分离病原菌。

1.2.1.2 病原菌分离与纯化 在病健交界处切取适当大小的组织块，在75%乙醇中浸泡30 s～1 min或0.1%升汞中浸泡3～5 min进行消毒，用无菌水漂洗3次，接种在PDA培养基上，置于25 ℃黑暗条件下培养2 d，挑取菌落边缘菌丝，转至PDA平板上进行纯化，经显微形态鉴定后，转至PDA试管斜面4 ℃保存。

1.2.1.3 病原菌形态学观察 将病原菌接种在PDA培养基上于25 ℃恒温黑暗培养，观察菌落特征，详细记录菌落的形态、颜色、直径等，并且随机测定100个分生孢子大小。在PSA培养基上25 ℃培养3～4周后，观察是否有有性态的产生。将病原菌的分生孢子形态和大小以及有性态的有无作为形态鉴定的依据，通过查阅相关文献[13-14]，确定病原菌的分类地位，并根据病原菌的培养性状和显微形态特征，统计分离得到的病原菌种类和比例，确定优势菌群。

1.2.1.4 病原菌致病性测定 采用伤根接种法对分离得到的病原菌进行致病性测定。

(1)接种体准备：将供试菌株在PD液体培养基中28 ℃振荡培养5 d，4层无菌纱布过滤后，打碎菌丝体，加适当无菌水稀释成菌丝体悬浮液。

(2)接种：接种前适时浇水保持营养钵内基质湿润，用玻璃棒在距草莓幼苗根茎约2 cm处扎一孔，再用灭菌刀片在草莓须根部造成伤口若干，将25 mL的接种体悬浮液灌入孔内，设3次重复，每次重复5株，即每个菌株共接种15株草莓幼苗。设伤根不接种为空白对照。保湿48 h后将植株转入光照强度5 000 lx、25～30 ℃的温室培养。

(3)病情调查：接种14 d后根据草莓炭疽病分级标准进行病害调查，并根据柯赫氏法则，对发病植株进行病原菌重新分离，显微观察得到的病菌是否与原接种菌株相同。

草莓炭疽病分级标准：0级，无病症；1级，发病部出现浅红色和褪色晕圈，或红褐色斑点，病斑平均长度≤2.0 mm，叶片边缘有少量红褐色病斑；3级，病斑沿叶柄或匍匐茎方向向两侧扩大呈梭形黑褐色凹陷病痕，病斑平均长度在2.1～5.0 mm；5级，出现典型的纺锤形病斑，病斑平均长度在5.1～9.0 mm；7级，病斑扩大，平均长度为9.1～15.0 mm；9级，叶柄或匍匐茎发病部呈黑色抽缩状，发病叶柄的叶片伴随出现萎蔫，病斑平均长度>15.0 mm。

1.2.2 防治草莓炭疽病生物药剂筛选

1.2.2.1 试验设计 试验于2018年10月19日—11月2日在顺义区南法信镇衙门村的北京市植物保护站新技术试验示范基地草莓温室进行。温室大棚中草莓长势均匀，处于育苗期，炭疽病零星发生，肥水管理一致。试验设7个处理(表1)，每个处理重复3次，采用随机区组排列，每个小区长7 m、宽3 m，小区面积为21 m2。

1.2.2.2 施药时间及方法 施药时间：2018年 10月19日施药1次。

施药方法：按药剂使用说明书推荐剂量进行喷施，使用喷雾器均匀喷施药剂于植株各部，空白对照区喷施等量清水。

1.2.2.3 调查方法 每小区对角线5点取样，每点调查5株共25株，分别于施药前，施药后7、14 d调查植株发病情况，根据1.2.1.4中的分级标准记录不同处理的病株病级，计算病情指数和防治效果。

病情指数=Σ(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级值)×100，防治效果=[1-(CK0×PT1)/(CK1×PT0)] ×100%。

式中，CK0表示空白对照区施药前病情指数，CK1表示空白对照区施药后病情指数，PT0表示药剂处理区施药前病情指数，PT1表示药剂处理区施药后病情指数。

数据应用SPSS统计分析软件进行分析，差异显著性分析采用Duncan’s新复极差法(SSR法)。

2 结果与分析

2.1 草莓炭疽病病原鉴定结果

从120个样本上共计分离到136个菌株，在PDA上培养的菌落早期均为白色，3～4 d后菌落可以分为2种类型：一种表现为菌落中间灰色(灰黑、青灰色或者灰白色)，边缘新生的菌丝为白色地毯状，气生菌丝较少(图1A)，可产生无色、单胞、棍棒形的分生孢子，单孢大小为 (3.0～5.9)μm×(11.7～21.1)μm(图1C)，多数菌株可以产生有性阶段的子囊壳，棍棒状的子囊中有8个肾形子囊孢子，子囊孢子无色、单胞、椭圆形、略弯；另一种表现为菌落中间粉红色棉絮状，边缘新生菌丝白色，气生菌丝较多(图1B、1D)，产生的分生孢子无色、单胞、梭形，在PSA上不能产生有性阶段。

A: 胶孢炭疽菌菌落形态；B: 尖孢炭疽菌菌落形态；

通过对菌落形态和显微性状观察(图1)，按BOOTH[13]和余永年[14]的分类系统最终将其中119个菌株鉴定为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，占总分离菌株数的87.5%，将17个菌株鉴定为尖孢炭疽菌(C.acutatum)，占总分离菌株数的12.5%，初步明确引起京郊地区草莓炭疽病的病原优势菌为胶孢炭疽菌。

将分离得到的136个菌株接种到草莓幼苗上，其中有54株胶孢炭疽菌和9株尖孢炭疽菌对草莓幼苗有不同程度的致病力，其他分离得到的菌株均无致病力。结果再次表明，胶孢炭疽菌为京郊地区草莓炭疽病的致病优势菌种。

2.2 防治草莓炭疽病生物药剂筛选结果

由表2可知，在药后7 d，供试药剂对草莓炭疽病的防效从大到小依次为0.5%大黄素甲醚水剂(74.7%)、2%绿宝水剂(72.7%)、45%咪鲜胺水乳剂(71.2%)、1%蛇床子素微乳剂(64.3%)、1 000亿个/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(62.1%)、5%氨基寡糖素水剂(60.1%)，各药剂防效之间没有显著差异；药后14 d，2%绿宝水剂、0.5%大黄素甲醚水剂防效均在65%以上，分别为67.4%、65.7%，与对照药剂(45%咪鲜胺水乳剂)的防效(64.2%)没有显著差异，其他药剂防效均在50%以下，与对照药剂有显著差异。因此，2%绿宝水剂、0.5%大黄素甲醚水剂防治草莓炭疽病的速效性和持效性都很好。

表2 生物药剂对草莓炭疽病的防治效果

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters after the data in the same column indicate that the difference reaches a significant level(P<0.05).

3 结论与讨论

3.1 草莓炭疽病的病原鉴定

目前，国内外报道的草莓炭疽病病原菌主要有C.fragariae、C.gloeosporioides和C.acutatum3种[8,15]，而关于这3种病菌在我国具体的发生与分布还没有系统研究。本研究通过在北京市昌平区、平谷区和大兴区进行采样调查，并进行病原菌鉴定，最终确定引起这3个地区草莓炭疽病的病原菌为C.gloeosporioides和C.acutatum，而且C.gloeosporioides为优势菌群。

本试验针对北京部分草莓主产区草莓炭疽病病原菌种类进行研究，具有一定的代表性，但是没有对其他地区草莓生产区的病原菌种类进行鉴定，另外也没有进行分子生物学方面的鉴定，需在后期工作中继续开展研究。

3.2 防治草莓炭疽病生物药剂的筛选

本研究对防治草莓炭疽病的5种生物药剂进行筛选，结果表明，2%绿宝水剂、0.5%大黄素甲醚水剂在药后7、14 d防效均在65%以上，且与对照药剂45%咪鲜胺水乳剂的防效没有显著差异，其他药剂在药后14 d防效均在50%以下，与45%咪鲜胺水乳剂有显著差异。因此，2%绿宝水剂、0.5%大黄素甲醚水剂对草莓炭疽病防治的速效性和持效性均较好。

生物农药作为绿色、有机农产品最主要的投入品之一，因其选择性强、对有害生物高效、对人畜安全、对环境友好、不易产生抗药性、生产原料广泛[16-17]等特点，在现代农业生产中具有越来越重要的地位。目前生物农药的防效日益提高，很多生物农药的防效已与化学农药相当[18-20]，甚至优于化学农药[21-22]。迮福惠等[18]通过田间试验发现，1%蛇床子素水乳剂对草莓白粉病的防效与4%朵麦可水乳剂的防效相当。王美林等[20]的研究发现，1 000亿个/g枯草芽孢杆菌对草莓炭疽病的防治效果与25%多菌灵可湿性粉剂、450 g/L咪鲜胺水乳剂的防效相当。由本试验研究结果可知，2%绿宝水剂和0.5%大黄素甲醚水剂的防效与45%咪鲜胺水乳剂没有显著差异，因此，在草莓炭疽病的防治中，2%绿宝水剂和0.5%大黄素甲醚水剂可以替代化学农药，建议在生产中推广使用，从而有效提高草莓生产和食用安全。