构建多模式全光谱暗场显微镜用于纳米单颗粒局域表面等离子共振实时动力学研究

刘磊，郝亚亚，邓素辉，王坤，李江，王丽华，樊春海，李嘉隽,＊，柳华杰,＊中国科学院上海应用物理研究所，上海 20800

2中国科学院大学，北京 100049

1 引言

随着纳米材料的蓬勃发展和在生物、环境、医学等领域的广泛应用，其带来的生物安全性以及生物效应等问题引起了社会的广泛关注。例如，纳米金、银等贵金属纳米颗粒在临床医学诊断和抗菌等领域得到广泛应用1,2。目前科学家已经从多个层次开展相关研究，例如在分子层面研究了纳米材料与聚合物高分子、小分子、生物大分子的相互作用3,4，在细胞层面研究了纳米材料与细胞及其微环境的相互作用5,6，在活体层面研究了纳米材料进入活体的过程和生物效应等等7,8。细胞作为生命活动的基本单元，研究其与纳米材料的相互作用机制对于我们理解纳米材料产生的效应具有重要意义。

显微镜成像技术在研究贵金属纳米材料与细胞的相互作用中发挥着重要作用9。例如电子显微镜、原子力显微镜、近场扫描光学显微镜、暗场显微镜、激光共聚焦显微镜等，利用显微镜可以观察贵金属纳米材料在细胞内的分布和定位等信息。然而由于成像方法本身的特点以及所用探针性质的限制，目前对于实时观察贵金属纳米颗粒与细胞的相互作用还存在着巨大挑战。例如电子显微镜不能对活细胞进行成像，原子力显微镜和近场扫描光学显微镜的扫描速率很慢等，这些都限制了其在细胞与纳米材料相互作用实时研究中的应用。单分子、单颗粒水平的荧光成像技术提供了揭示细胞内单分子水平生化反应动态过程的有效手段，使实时追踪纳米颗粒的运动和定位信息成为可能10-12。然而，现有的基于荧光探针的单颗粒成像方法通常存在一对无法克服的矛盾：一方面，为了实现较高的时空分辨率，我们需要借助大功率光源激发单颗粒上标记的荧光探针，以便在较短时间内搜集足够的荧光信号；而另一方面，强光源带来的荧光漂白作用又限制了长时间实时成像的能力。

贵金属纳米颗粒具有独特的局域表面等离子体共振(LSPR)特性，其发出的散射光可以被暗场显微镜(Dark Field Microscope，DFM)探测到。近年来的研究表明，基于纳米金等颗粒自身的LSPR性质，进行单颗粒暗场成像，避免了荧光成像方法的光漂白问题，因此成为了研究贵金属纳米颗粒与细胞相互作用的有效手段13-16。利用暗场显微镜，在单分子水平上对金属纳米颗粒的动态行为进行分析，对研究活细胞和组织的生物学行为、制备纳米功能材料、开发新的传感器具有重要意义17-19。例如，通过检测金属纳米颗粒的散射信号，可以分析其与细胞、生物分子的相互作用，揭示其聚集状态与胞内运输情况20-22。Xu小组通过单纳米颗粒追踪技术，成功观察到其进入细胞的动力学过程23-25，以及细胞膜和细胞壁对摄入金属纳米颗粒的选择性26。Raschke、Nusz等多个小组研究了单个纳米金颗粒与生物大分子的结合，并发展了相关的纳米传感器27-29。何彦课题组30基于纳米颗粒间距离变化导致的 LSPR光谱变化，发展了研究细胞膜表面力学信号传导动力学的新技术。

上述对单个金属纳米颗粒的LSPR光谱研究，采用的都是暗场显微镜-光谱仪联用装置。但是，现有的商业化暗场显微镜由于自带光源一般使用卤素灯，光强度弱、光谱范围窄，造成在进行单颗粒成像研究时，对散射信号较弱的样品需要的光谱采集时间较长，对更弱的样品甚至完全无法实现信号的采集。例如，对于粒径在30 nm以下的小颗粒纳米金，现有的商业化仪器无法在单颗粒尺度对其进行成像研究。另一方面，由于现有商业化仪器的封装限制，只能进行细胞轮廓的结构成像，无法进行功能成像，限制了对贵金属纳米颗粒与细胞相互作用研究的深入。例如现有暗场显微镜只能观察到纳米金进入细胞的过程和状态，无法同时观察其与特定的亚细胞结构共定位，获得纳米金与细胞内部相互作用的细节信息。

针对以上关键问题，本文首先通过设计重构暗场显微镜的照明模式，实现了在单颗粒水平上，对散射信号较弱样品的成功表征。我们利用超连续激光器作为外接光源，代替卤素灯光源，在经过光路耦合导入显微镜后，使对单个30 nm粒径纳米金的光谱采集时间可以缩短至1 ms。同时，对于细胞内功能成像的需求，我们通过加装光片成像系统，集成了荧光成像功能，可实现对亚细胞结构进行性质和功能上的分析。这一整合系统在商业化暗场下加装了一条斜照明光路，通过精确调整斜入射照明光的高度，实现光片成像，并可以通过对滤块的调整分别收集荧光信号和散射信号，实现多模式成像共定位。整套系统可以提供全光谱、高照明强度的暗场宽场照明模式以及暗场聚焦照明模式。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

Hela细胞购自上海生命科学研究院。3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、溶酶体染色剂(lysotracker)、CY3、胎牛血清(FBS)、双抗青链霉素、胰酶(trypsin)均购买于英潍捷基(上海)贸易有限公司，所有试剂未经进一步纯化直接使用。甲醇、乙醇购买自国药集团化学试剂有限公司，分析纯，可直接使用。纳米金和纳米银购自生工生物工程(上海)股份有限公司，超纯水稀释之后直接使用。35 mm玻璃底培养板购于生友生物科技公司；盖玻片、载玻片、细胞培养板和多孔板购于康宁公司。所有溶液采用Millipore系统的milli-Q超纯水(18 MΩ·cm电阻)制备。所有光学透镜和镜架购于索雷博光电科技(上海)有限公司。

2.2 实验过程

2.2.1 纳米金成像样品的制备

首先将纳米金颗粒吸附在玻璃表面，玻璃表面根据参考文献进行清洁和硅烷化处理31。具体地，将洗净后的盖玻片浸泡在摩尔浓度1% APTES的甲醇溶液中放置 12 h，然后依次用甲醇和超纯水冲洗玻璃片以去除多余的APTES和甲醇，之后放在120 °C的烘箱中3 h进行老化。将20 μL浓度为 10-30 pmol·L-1的纳米金溶液滴加在上述玻璃片上，5 min后用超纯水冲洗玻璃片以除去没有结合在玻璃片上的纳米金，氮气吹干后将玻璃片放在暗场显微镜的载物台上进行观察。

2.2.2 多模式全光谱暗场显微镜光路构建

我们通过使用超连续激光器(NKT SuperK EXTREME EXW-12)作为照明光源，替代传统的卤素灯，并改变其照明方式。在保留暗场显微镜原有功能的情况下，完成了宽光谱采集、高采集速度的多模式成像暗场显微镜改造。如图1光路图所示，超连续激光器所产生的400-1200 nm波长的连续谱激光首先穿过由两块透镜与一个针孔组成的空间滤波系统进行滤波与扩束。扩束后的激光由一块中间带有圆孔的反射镜(ID1)反射，圆孔为椭圆形，长轴7 mm，短轴5 mm，长轴水平放置。此时，激光的外围部分由反射镜反射形成了环形光，中间部分则穿过了反射镜的圆孔形成了光片照明模式的光源，直径约5 mm。环形光被一组透镜组(L3、L4)共轭至物镜(OLYMPUS UPlanFLN)的后孔径，并由后孔径的边缘被物镜聚焦至一个尺度接近光学衍射极限的光斑。在原有滤片盒中二相色镜的位置处安置一个尺寸与 ID1相同大小的圆孔反射镜(ID2)。由样品散射的光被同一个物镜所收集，其中散射信号透过 ID2的中孔，由光分路器(FC)实现分光，并被 CCD(OLYMPUS DP70)或者光谱仪(PRINSTON SP2300i)所接收。

图1 多模式全光谱暗场显微镜照明成像原理示意图Fig. 1 Schematic diagram of the multi-mode DFM.

该系统还整合了一套光片照明模式，从反射镜(ID1)圆孔中透过的激光经由反射镜反射至样品的斜上方，并由一块400 mm焦距的柱状凹面反射镜(THORLABS CCM254-100-P01)聚焦，从侧方形成100 μm厚度的光片，进行宽场照明。凹面反射镜的高度调节可由手动升降台提供。

2.2.3 纳米金暗场光谱采集与成像

将涂有纳米金的载玻片放在暗场显微镜的载物台上，调节聚光镜和物镜的位置并移动载物台，在视野里找到纳米金并进行聚焦。切换使用60/0.5-0.9 NA的干物镜，通过微调聚光镜的位置来获得最暗背景，微调Z轴和物镜的数值孔径(NA)来获得最佳信噪比。调节CCD相机的曝光时间为100 ms，ISO灵敏度为400，获取纳米金的暗场照片。切换光路至光谱方向，利用配置了谱线600光栅的光谱仪，调整狭缝宽度来获得单个纳米金颗粒的光谱。

2.2.4 细胞内纳米金暗场成像

将HeLa细胞铺在单孔玻璃底培养皿上，用1 ×PBS (磷酸缓冲液)将细胞洗涤2-3次，再加入0.2 mL含有 0.1 nmol·L-1纳米金的培养基(gibco MEM)，在培养箱中培养2 h。观察之前用1 × PBS洗涤 3-4次，并更换为不含酚红的培养基后，放在载物台上进行成像分析。

3 结果与讨论

3.1 多模式全光谱暗场成像原理

暗场显微镜又称作暗视野显微镜，成像原理在于使用暗场聚光镜将光源中间部分光线屏蔽并聚焦，使其避开物镜的接收范围，从而使检测器只能接收到由样品产生的散射光(见图S1，Supporting Information)。在暗场模式下显微镜能极大的降低成像背景的亮度并提高成像信噪比，从而达到观察弱散射信号样品的目的。

传统的暗场显微镜使用卤素灯作为光源，其强度以及光谱范围不足以对单颗粒金属纳米颗粒进行实时观察。针对此，我们使用超连续激光器作为照明光源，并对光路进行重构。我们采用一块中间带有圆孔的反射镜将超连续激光器所产生的全光谱激光分为两路。其中激光的外围部分由反射镜反射形成了环形光，这束高强度激光进而被物镜聚焦在样品上，产生较强的散射信号，极大地缩短了对单分子金属颗粒采集光谱的时间。另一方面，激光的中间部分则穿过了反射镜的圆孔形成了光片照明模式的光源，通过精确调整这束斜入射照明光的高度，我们可以提供宽光谱、高照明强度的暗场光片照明模式。通过在光路中加装带通滤片与选择显微镜中与之对应的滤片盒，该系统还能提供与暗场成像共定位的荧光成像功能。样品所产生的散射光及荧光被同一个物镜所收集，并进而被聚焦至CCD相机或光谱仪，可以分别实现暗场成像、荧光成像与光谱分析等功能。

通过以上改造，该仪器在基本暗场采集成像功能基础上，实现了400-1200 nm宽光谱暗场与荧光信号的采集与成像、单个30 nm粒径纳米金颗粒1 ms时间高采集速度的多模式成像功能。荧光成像与暗场成像相互补充，可实现对纳米金颗粒与亚细胞结构共定位功能成像。

3.2 暗场信号采集与成像性能的提升

暗场显微镜成像收集得到的信号通常与样品的散射和照明光源强度相关。在本系统中，通过引入具有高照明光源强度的超连续激光器，可以实现对散射信号较弱的样品光谱的快速采集。

首先，为了验证光片模式下暗场成像效果的提升，我们分别使用了70 nm边长的纳米金三角片和50 nm粒径的纳米金球颗粒作为研究对象(图2)。两者的形貌使用透射电子显微镜进行了表征(图2a，b)。图2c是用普通卤素灯作为光源对纳米金三角片的暗场成像结果(曝光时间100 ms，ISO灵敏度为400，卤素灯照明强度100%，输出为DC 12 V 8.4 A)，分析后表明信号极其微弱。与之相反，图 2e显示在超连续激光暗场光片照明模式下(曝光时间100 ms，ISO灵敏度为400，照明强度20%，实测照明功率5.7 mW)，在大视野下可清晰地观察到单个70 nm纳米金三角片独有的红色特征峰的散射信号。对50 nm纳米金球的表征反映了同样的结果(图2d，f)。在相同的曝光时间下(100 ms)，利用超连续激光使用光片照明，通过比较绿色特征峰的散射信号，统计分析发现(见表S1、S2，Supporting Information)，其信噪比相较于卤素灯照明提高了 100倍(图 2g，计算方法见 Supporting Information)。以上结果证明，我们自行搭建的超连续激光暗场成像系统在成像效果方面有了显著提升。

图2 超连续激光光源显著提高纳米金的信号强度Fig. 2 The contrast of the Signal intensity before and after improvement.

然后，我们将光片照明模式切换至聚焦模式来实现更大光强照明，提高光谱采集速度，借此实现对更小颗粒的快速信号采集，达到对纳米金属单颗粒进行实时光谱分析的目的。在对某一特定单颗粒进行光谱测量时，在聚焦模式下，通过严格控制照明光斑的形状来实现照明中心的高强度，实现在极短时间内收集到足够强的光谱信号。图3是在聚焦模式下获得的30 nm纳米金颗粒与40 nm纳米银颗粒的暗场成像信息与光谱数据。相对于光片照明，聚焦式照明的散射信号强度有了明显提升。在实测照明总功率170.1 μW、曝光时间100 ms的条件下，纳米金颗粒(图3a)与纳米银颗粒(图3c)具有很强的散射信号，甚至产生严重过曝现象。对两者进行光谱分析(图3b，d)，确定了纳米金颗粒在540 nm、纳米银颗粒在480 nm有强散射特征峰。

图3 多模式暗场聚焦模式成像Fig. 3 Imaging of Multi-mode DFM in focus illumination mode.

图4 聚焦模式暗场测得30 nm金在不同曝光时间下的光谱信息Fig. 4 The spectrums of 30 nm gold nanoparticles with different exposure times measured in focus illumination mode.

在此基础上，我们进一步优化曝光时间，来获得更快的时间分辨率，从而进行实时动态成像。我们对30 nm的纳米金在聚焦模式照明下进行光谱分析，曝光时间分别为1、5、15、25 ms，如图4所示。结果显示，在聚焦模式下仅需1 ms的曝光时间就足以获得完整的光谱信息，其特征峰与长时间曝光所得数据保持一致，这为观察纳米金属颗粒的动态过程奠定了基础。超高的时间分辨率可以及时捕捉生化事件的动态信息，极大的降低动态追踪过程中重要信息和事件的丢失率。通过检测光谱的实时变化可以判断纳米金的聚集状态以及实时变化过程。

图5 多模式暗场在生物分析的应用Fig. 5 Application of the Multi-mode DFM in bioresearch.

3.3 多模式成像用于实际生物分析

该系统除了暗场模式，通过激发与发射滤块的组合与切换，还能同时提供荧光成像模式来实现细胞内荧光与纳米金散射图像的共定位，这为纳米金颗粒在细胞内的分布和定位提供了依据。

图5为利用暗场成像模式和荧光成像两种模式来观察金纳米颗粒进入细胞的过程。图5a是用Cy3标记获得的溶酶体荧光成像结果，5b为暗场成像模式下纳米金颗粒的分布信息，5c是二者的共定位。从中可以看出，溶酶体和纳米金有很好的共定位，初步反映纳米金进入细胞后会被溶酶体吞噬。此外，我们还对纳米金颗粒进行了实时追踪检测(见Supporting Information中的视频)，可以通过其颜色与光谱的变化，观察纳米金的聚集过程。在整个追踪过程中，暗场中首先观察到初始的绿色亮点转变为黄色，表明单颗粒在进入细胞后发生了聚集，这可能反映了纳米金被溶酶体所吞噬。然后，又转变为单颗粒纳米金所具有的绿色，这有可能是被溶酶体吞噬后又重新在胞内释放的结果。由此可见，改造后的多模式全光谱暗场显微镜既具有超高的时间分辨率，又具有荧光显微镜功能成像共定位的能力。通过对纳米金等具有LSPR特性的探针进行长时间实时检测，我们可以对亚细胞结构里的生物生化反应过程进行追踪和分析，为研究纳米材料与细胞的相互作用提供了有力手段。

4 结论

本文通过引入超连续光谱激光器，改变照明模式等对暗场显微镜进行改造，提高了暗场成像光源的亮度与光谱的范围，大大提高单颗粒光谱采集的时间分辨率，拓展了光谱采集的波长范围。在对纳米金的检测效果上，显著提高了纳米金的信号强度、检测灵敏度和检测速度。相较于改造之前的暗场-光谱仪联用显微镜，我们获得了高于卤素灯照明 4个数量级的信号，可以检测到尺寸低至30 nm的纳米金颗粒、数目低至单个颗粒的光谱，同时可以将全光谱采集时间从100 ms缩短至1 ms。该体系可以显著降低动态追踪过程中重要信息和事件的丢失率，可以满足实时研究生物体内的生化反应的需求，例如，蛋白-蛋白相互作用、核酸-蛋白相互作用等32-37。同时保留了暗场成像可长时间实时追踪的优势。该成像系统可以更精确地用于细胞内单颗粒的动态追踪，为生物学基础研究与生物医学应用提供有力的工具。同时我们还在商业暗场显微镜上实现了荧光成像和暗场成像的联用，并用该系统证明了纳米金进入细胞后定位在溶酶体内部。该系统的成功搭建为研究纳米材料与细胞的相互作用提供了有力手段。

Supporting Information:available free of chargeviathe internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.