荆州博物馆文物展陈环境空气中真菌数量及其群落特征

雷 琼，肖 璇，马立安，章 俊，詹亚斌，方 芳， 邱祖明

(1． 湖北省荆州文物保护中心，湖北荆州 434020； 2． 荆州博物馆，湖北荆州 434020；3． 长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025； 4． 广东省微生物研究所，广东广州 510070)

0 引 言

存在于空气中的微生物种类很多，仅真菌就有40 000余种[1]。博物馆展陈环境作为相对密闭空间的总体[2]，既有陈列的可移动文物，又有前来参观的游客，若发生空气微生物严重污染，不仅会导致有机质文物的霉变，还会对游客的健康构成威胁[3]，因此很有必要对博物馆内空气微生物展开研究，国内外博物馆均开展了这项工作[4-8]。目前对博物馆环境中空气微生物研究多集中在室内和室外空气微生物的对比，以及展厅内微生物动态变化方面，且侧重分析这些微生物对人体健康的影响，对小环境如展柜内空气微生物，以及这些微生物对文物的潜在危害研究和分析较少。

为调查荆州博物馆文物展陈环境中潜在的微生物病害，研究空气中真菌数量及分布特征，采用自然沉降法对展柜和展厅空气中真菌进行采样，统计真菌数量，进行形态和分子鉴定，并分析真菌群落分布特征。该研究可为馆藏文物的预防性保护提供科学依据，对了解馆内空气污染现状，保护游客健康和文物安全具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1．1 调查对象

以荆州博物馆3处展厅及其中的展柜为调查对象，对文物陈列展柜、展柜所在的展厅进行空气微生物采样，分别为青铜器展厅、青铜器展柜；木漆器展厅、木漆器展柜；纺织品展厅、纺织品展柜，具体信息如表1所示，展厅和展柜全年温度，相对湿度(RH)如图1所示。由图1可知，除纺织品展柜相对湿度相对稳定之外，其他展厅和展柜全年相对湿度起伏不定，大部分在50%以上，木漆器展厅和展柜相对湿度不低于60%。各展厅和展柜全年温度变化趋于一致，7月份温度最高，在30 ℃左右。

表1 采样展柜、展厅详细信息

注： 表中温度、相对湿度值为采样时所测值。

1．2 空气真菌采样、培养及计数

参照医院消毒卫生标准[9]和馆藏文物保存环境质量检测技术规范[10]，于2014年7月14日博物馆闭馆日，选取最具代表性的3个展厅展柜为采样点，每个采样点依据空间大小依次放置4～6个直径9 cm的马丁-孟加拉红培养基平板。除阴性对照不开盖，其它培养皿暴露在空气中10 min后，盖上皿盖，所有取样过程在1 h内完成。将平皿放入培养箱28 ℃倒置培养5 d，逐日观察，于第5 d计数。空气中真菌总数(单位CFU/m3)按以下公式进行计算：m=N×5 000/(A×t)。其中m为空气中真菌总数，单位为CFU/m3；N为平皿平均菌落数，单位为CFU；A为平皿面积，cm2；t为平皿的暴皿时间，单位为min。

1．3 菌种鉴定

1．3．1真菌形态鉴定 挑取马丁-孟加拉红培养基上所有单菌落，转接至马铃薯培养基中进行纯化培养，依据展陈位置进行编号(青铜器展厅分离到的真菌编号为A开头，木器漆展厅为B，纺织品展厅为C，青铜器展柜为Q，木漆器展柜为M，纺织品展柜为F)。通过观察菌落形态，结合分生孢子、菌丝等显微形态特征，对照工具书[11-12]将部分真菌鉴定到属。不能鉴定到属的真菌，将形态特征相同的归为一类，每一类选取一个代表菌株进行下一步分子鉴定。

1．3．2真菌分子鉴定 采用微波裂解法[13]，得到真菌DNA模板，以真菌ITS区域通用引物ITS5(5’-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[14-15]进行PCR扩增。使用生工快速扩增试剂盒，反应体系为50 μL，PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃终延伸10 min。PCR扩增完毕，产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物直接送上海生工进行测序。测序返回的真菌ITS序列在NCBI数据库上进行同源性搜索比对，进行序列嵌合体检测，将获得的序列上传至NCBI数据库，获得序列号。然后利用MEGA5软件构建系统发育树，获得基于ITS序列的系统发育树。

2 结 果

2．1 展柜、展厅空气中真菌数量

展柜、展厅中空气中真菌数量见图2，真菌数量在12～74 CFU/m3之间，从高到低依次为木漆器展厅(74 CFU/m3)、青铜器展厅(38 CFU/m3)、青铜器展柜(21 CFU/m3)、纺织品展厅(17 CFU/m3)、纺织品展柜(16 CFU/m3)、木漆器展柜(12 CFU/m3)。青铜器和木漆器的展柜中真菌数量显著低于展厅(P<0.05)；纺织品中展柜和展厅中真菌数量无显著性差异(P>0.05)。

2．2 真菌鉴定结果

2．2．1形态鉴定 通过观察土豆培养基上的菌落形态，并用石碳酸棉兰染色镜检，初步鉴定出部分枝孢属、青霉属、链格孢属等真菌，如图3所示。其中，镰刀菌在马丁-孟加拉红培养基生长5 d，其他菌在土豆培养基生长12 d；曲霉在1 000倍油镜下观察，其他菌400倍。

2．2．2分子鉴定结果分析 将各菌株ITS序列在GenBank中进行同源性比对，结果如表2所示。

除了菌株B4-14，其余菌株与最相近菌株同源性大于99%(表2)，且在系统发育中处于同一分支(图4)，由此可确定菌株C6-1、B1-3、B4-11均为枝孢霉属，B5-9为Valsaria，B5-2为青霉属，A2-5为镰刀菌，B4-16为Hansfordia，B4-5为弯孢聚壳属，B4-14与弯孢聚壳属菌株同源性为97%，结合系统发育地位，推断其为弯孢聚壳属中的疑似新种，值得进一步做鉴定，以上菌属均划入半知菌类(FungiImperfecti)。同样可知，B4-10、A4-4为小球腔菌属，B3-3、B3-5为暗球腔菌属，B5-6为Phaeosphaeriopsis，以上3属属于子囊菌纲(Ascomycetes)。此外，A4-1被鉴定为鬼伞属，B2-3亦为鬼伞属，C5-1为木耳属，B1-1为Agaricaceaesp．，以上4属为担子菌纲(Basidiomycetes)。

2．3 真菌种群分布

如表3所示，共分离到105株真菌，除了6株菌鉴定失败，其他99株真菌分别属于19个属。木漆器展厅空气中分离出14属，青铜器展厅空气中分离出8属，纺织品展厅空气中分离出6属，纺织品展柜空气中分离出4属，青铜器展柜空气中分离出6属，木漆器展柜空气中分离出6属。枝孢属和小球腔菌属分别占真菌总数的24.76%、22.86%，为优势真菌。在展柜和展厅中均发现有枝孢属存在，小球腔菌属主要存在于展厅环境中。在展柜中分离到卵形孢霉属和链格胞属，在青铜器展厅和展柜中分离到酵母菌，鬼伞属、木耳属等担子菌纲真菌只分布于展厅中。

菌株编号分离菌序列编号参考序列编号参考序列分离源种属相似性指数/%B1-3MG732979KX527874Cladosporium cladosporioides voucher BJ1-10芽枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)99C6-1MG732980KX349488Cladosporium tenuissimum isolate Fck-3-45极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)99B4-11MG732981KY498319Cladosporium sp. strain KACC 48134枝孢属(Cladosporium sp.)99B3-3MG732982KT224848Phaeosphaeria papayae isolate S70Phaeosphaeria papayae99B3-5MG732983KF143800Phaeosphaeria sp. XJ25暗球腔菌属(Phaeosphaeria sp.)99B4-5MG732984KP743030Eutypella sp. ZZ2弯孢聚壳属(Eutypella sp.)100B4-14MG732985KU320618Eutypella sp. 416弯孢聚壳属(Eutypella sp.)97B5-2MG732986KT189507Penicillium sp. H11-2青霉属(Penicillium sp.)99A2-5MG732987KU847854Fusarium graminearum isolate 110镰刀菌(Fusarium)99B5-6MG732988KX527871Phaeosphaeriopsis musae voucher BJ1-6Phaeosphaeriopsis99B5-9MG732989NR_138403Valsaria insitiva CBS 127882Valsaria99A4-1MG732990FJ478115Coprinopsis atramentaria strain xsd08072鬼伞属(Coprinopsis)99B4-16MG732991KP772241Hansfordia pulvinata voucher HMQAU130012Hansfordia99B1-1MG732992KM268691Agaricaceae sp. GWY1(1)Agaricaceae sp.99C5-1MG732993FJ617293Auricularia polytricha voucher Dai10451木耳属(Auricularia)99A4-4MG732994KX611651Leptosphaeria sp. isolate DOF-28小球腔菌属(Leptosphaeria sp.)99B4-10MG732995KJ531966Leptosphaeria sp. LCC1-2小球腔菌属(Leptosphaeria sp.)99B2-3MG732996KJ028784Coprinellus xanthothrix isolate NEFU33鬼伞属(Coprinellus)99

真菌属名分离真菌菌株数量/CFU青铜器展柜青铜器展厅木漆器展柜木漆器展厅纺织品展柜纺织品展厅总计百分比/%枝孢霉属24210442624.76小球腔菌属07114022422.86鬼伞属(Coprinellus)05030198.57弯孢聚壳属00040376.67酵母菌(Saccharomyces)23000054.76

(续表3)

注： 菌株数量为采用自然沉降法在培养基上形成的CFU数量。

除未知真菌外，其他真菌按其所属纲类被分为4类，分别为半知菌类(FungiImperfecti)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)及藻状菌纲(Phycomycetes)，各占真菌总数的50.48%、30.48%、12.38%及0.95%。

3 讨 论

虽然纺织品的中展柜和展厅中真菌数量无显著性差异，但是青铜器和木漆器的展柜中真菌数量显著低于展厅，总体而言，展厅空气中分离到的真菌数量整体多于展柜，木漆器展厅空气中分离到的真菌数量和种类最多，可能与其所处位置、空气温度和湿度以及人流量有关系[16]。木漆器展厅位于一楼，且离楼房出口较近，楼外又有绿水环绕，导致展厅内湿度偏高，霉菌生长的最佳条件为温度22～32 ℃，相对湿度90%～100%[17]，较高的相对湿度能够增加空气细菌和真菌的水平[18]。纺织品展柜和展厅中霉菌较少，除了温湿度的原因外，还可能与其入口放置的鼓风装置有关，可在一定程度上阻止室外的空气微生物进入展厅。展柜相对于展厅，是一个更加密闭独立的空间，人流量对其影响较小，且温湿度变化相对较小，这些可能是展柜内真菌数量相对较少的原因。据研究，展柜特有菌卵形孢霉属和链格孢属，主要对植物产生侵害，多以植物内生菌的形式存在于植物组织内部[19]，可能会对木质文物有危害作用。在青铜器展厅和展柜中分离到酵母菌，可能与青铜器文物有关，具体原因，还有待进一步研究。

从博物馆馆藏环境空气中分离到的真菌中，空气真菌优势菌群为半知菌类，其次是子囊菌纲，国外研究人员从西伯利亚南部大气环境中主要分离到子囊菌、半知菌、接合菌等真菌[20]，与本研究结果基本相似。从属水平来看，优势真菌依次为枝孢属和小球腔菌属。据报道，国内外空气中优势真菌里经常出现枝孢属。马燕天等研究敦煌莫高窟空气中微生物的种群动态和群落，发现优势真菌为枝孢属，无孢菌，青霉属等。方治国等[21]对北京市夏季空气微生物的群落结构和分布特征开展研究，发现的优势真菌中就有枝孢属，为总数的47.2%，占绝对优势。符春兰等[22]对国内4座大城市空气真菌的研究表明，优势菌属为枝孢属、链格孢属等。此外，国外研究[23-24]也将空气中的优势菌属归于枝孢菌属、链格孢属等。小球腔菌属极少出现在空气中优势菌属中。

据报道，枝孢属真菌中存在条件致病菌，在生长代谢过程中可能会产生潜在毒素枝孢霉素，危害人体健康[25]。冯清平等从莫高窟洞窟内分离得到枝孢霉和黑曲霉，这两种真菌在一定程度上加速了壁画红色颜料变色和胶结材料的老化进程。枝孢霉可以分解壁画颜料中的骨胶，并利用其生长和形成草酸等代谢产物，促进了铅丹向铅白的转变[26]。小球腔菌属一般在沼泽草地中比较常见[27]，在中国报道的小球腔菌属以病原菌为主[28]。另外，分离出的鬼伞属、木耳属等担子菌纲真菌，虽然只发现于展厅中，但若发生大范围污染，对木质文物危害性比较大。据报道[29]，西安市高陵县院张村明代墓考古发掘现场出土木质棺椁表面大量生长的白色病害微生物，经鉴定为担子菌纲真菌。

枝孢属，小球腔菌属及担子菌纲真菌对文物和人体健康具有一定危害。根据全年温度和相对湿度曲线，推测4～9月份可能是诱发真菌萌发的时间段。经常开窗通风可有效控制室内微生物污染，除尘、净化及紫外线照射等物理消毒法也可降低空气微生物污染程度。此外，化学消毒法和中药消毒法在空气消毒领域也得到一定的应用[30]。

4 结 论

通过对荆州博物馆文物展陈环境展厅和展柜空气中真菌的数量和种类进行了初步调查，对展厅和展柜空气中真菌的数量和种类差异进行了比较分析，发现展厅空气中的真菌数量和种类普遍多于展柜，木漆器展厅真菌数量最高，种类最丰富。枝孢属和小球腔菌属为展陈环境中优势菌属，在6月和7月温湿度适宜的条件下，容易大规模生长，对文物或人体具有一定危害，应采取空气消毒措施。本研究只取一次样，拟对荆州博物馆文物展陈环境中的真菌进行初步调查分析，研究内容不够深入。在以后的工作中，将不间断取样，分析不同时段真菌的种属和数量的差异，对真菌的种属和数量进行动态研究，密切关注空气微生物污染状况。总而言之，该研究结果对了解馆内空气污染现状，保护游客健康和文物安全具有重要的现实意义。