卵泡液抗苗勒氏管、激活素A及骨形成蛋白对不孕女性卵巢反应性及妊娠结局的预测价值

衷雪梅 金萱

1南昌大学医学院（南昌330006）；2南昌大学第一附属医院辅助生殖中心（南昌330006）

卵泡液抗苗勒氏管激素（AMH）、激活素A（Activin A）、骨形成蛋白（BMP-15）属转化生长因子β（TGF-β）超家族，是卵源性因子、分别由卵泡颗粒细胞和卵母细胞分泌，对卵泡发育和卵母细胞增殖都有意义。从始基卵泡阶段到排卵至黄体形成期，它们参与协调卵泡的招募、选择和发育成熟，甚至与多种卵巢疾病的发生发展有关［1］。在辅助生殖技术（ART）应用中，AMH浓度可以反映女性原始卵泡的库存情况，是评估卵巢储备功能的可靠指标［2］。研究发现BMP-15调控卵母细胞质量，并且与控制性超促排卵（COH）卵巢反应性相关［3-4］；动物实验发现Activin A能够促进卵泡发育、减少闭锁卵泡的比例［5］。目前ART研究中多为血清AMH浓度对卵巢反应性的影响，BMP-15和Activin A的研究集中在动物实验，尚缺乏卵泡液因子对卵巢反应性及临床妊娠结局影响的研究。本研究旨在分析黄体中期长方案中各检测指标对卵巢反应及临床妊娠结局的预测价值，试图为AMH、BMP-15、Activin A与COH过程中卵巢发应性及妊娠结局的相关性研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2017年9月至2018年1月在南昌大学第一附属医院辅助生殖中心行IVF/ICSIET治疗的患者，共计155个周期。纳入标准：（1）年龄20～40岁；（2）促排卵方案采用黄体期长方案；（3）无基础卵巢疾病；（4）甲状腺、肾上腺等未见明显异常；（5）基础FSH≤12IU/L。排除标准：（1）多囊卵巢综合征、卵巢功能不全；（2）子宫畸形、宫腔粘连、子宫内膜异位症；（3）既往有结核病史，或有Cushing综合症、垂体肿瘤和糖尿病等其他系统疾病。

1.2 分组标准根据获卵数分组，（1）低反应组：获卵数≤ 4个；（2）正常反应组：5 ～ 15个；（3）高反应组：＞15个。将新鲜移植周期按年龄（＜35岁）分组［6］，根据妊娠情况分妊娠组和未妊娠组。

1.3 方法

1.3.1 黄体中期长方案促排卵于前一个月经周期黄体中期开始皮下注射促性腺激素释放激素激动剂（Gonadaotropin releasing hormoneagonist，GnRH-a）（达必佳德国辉凌）进行降调节，月经来潮的第3 ～ 5天复诊，达到降调节标准［7］（降调标准：阴道B超检测卵泡直径≤5 mm，子宫内膜＜5 mm；血清雌激素（E2）＜30 pg/mL黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、FSH ＜ 5 IU/L，）后开始使用Gn促排，剂量为75～300 IU/d，根据患者年龄、体重、血清基础性激素水平、基础窦卵泡数及以往治疗周期的卵巢反应性进行调整。超声监测卵泡发育情况，同时监测血E2、P、LH、FSH水平来调节Gn剂量。当双侧卵巢内有1个及以上卵泡平均直径达18 mm或3个及以上卵泡平均直径达17 mm时，结合血清性激素水平，停药，于当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）（艾泽瑞士默克雪兰诺），36～38 h后行阴道超声引导下穿刺取卵术。

1.3.2 标本采集和处理取卵日留取患者第一管卵泡液（卵泡平均直径≥17 mm，且无明显血染的卵泡液纳入研究），经3 000 r/min离心（TGL-168上海安亭科技仪器厂）10 min后，取上清液留置于Eppendorf离心管，标记后-80℃保存待测。

1.3.3 标本检测采用双抗体夹心ELISA法试剂盒（BioVision美国），对155例患者的卵泡液中Activin A、Bmp-15、AMH蛋白含量进行检测。

1.3.4 胚胎评分及妊娠结局判定标准根据本中心胚胎评分标准，选择2枚2PN发育而来的优质胚胎移植（优质胚胎标准：卵裂球数目6～8个，碎片≤10%，卵裂球无明显大小差异的胚胎）；若无优质胚胎，则选择可移植胚胎［可移植胚胎标准：第3天的4细胞Ⅱ级以上或6细胞Ⅲ级以上的胚胎］。剩余可利用胚胎取得患者知情同意后行玻璃化冷冻，发育缓慢的胚胎再培养至第5～6天，形成囊胚后行玻璃化冷冻。移植胚胎后14 d及17 d分别测定血清hCG值，当hCG为阳性时确定生化妊娠；移植后28 d腹部超声检查见孕囊确定为临床妊娠。

1.3.5 观察指标基础窦卵泡数（antral folliclecount，AFC）于月经来潮第2～3天经阴道超声测定双侧卵巢卵泡平均直径2～10 mm之和。IVF总受精率=（2PN卵子数+1PN卵子数+多PN卵子数+0PN卵裂卵子数）/IVF加精卵子总数×100%；ICSI总受精率=（2PN卵子数+1PN卵子数+多PN卵子数）/注射MII期卵子总数×100%；β-hCG阳性率=β-hCG阳性周期数/移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%。

1.4 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料用表示；采用独立样本t检验和单因素方差分析检验（ANOVA），若方差不齐则采用非参数检验。计数资料采用卡方检验。使用Logistic回归分析法分析影响卵巢反应和临床妊娠结局的因素，同时构建患者受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）确定cut-off值以评估各预测指标价值，当ROC曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve，AUC）＞0.9时有最佳预测价值，在0.7～0.9时有预测价值，在0.5～0.7时预测价值较低。P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的临床特征共纳入155例患者，其中低反应组14例，正常反应组93例，高反应组48例；新鲜周期移植者共93例，＜35岁患者70例。

2.2 不同卵巢反应患者临床资料和卵泡液检测指标的比较不同卵巢反应的患者，体质量指数（body mass index，BMI）无差异；年龄、基础AFC、基础FSH不同，差异有统计学意义（P＜0.05）。Gn总量与获卵数差异有统计学意义（P＜0.01），卵巢反应性越高，Gn总量越低，获卵数越多。卵泡液（follicular fluid，FF）Activin A、AMH水平均无差异，低反应组与高反应组卵泡液BMP-15水平均高于正常反应组。IVF/ICSI总受精率不同，差异有统计学意义（P＜0.05），高反应组受精率最高。在新鲜周期移植的患者中，高反应组临床妊娠率高于低反应组，均明显高于正常反应组。见表1。

表1 不同卵巢反应患者临床资料和卵泡液检测指标比较Tab.1 Comparison of clinical data and follicular fluid detection indexes in patients with different ovarian response x±s

2.3 年龄＜35岁不同妊娠结局患者临床资料和卵泡液检测指标的比较妊娠组与未妊娠组BMI、基础AFC、Gn总使用剂量均无差异；妊娠组FFAMH、FFBMP-15、FFActivin A水平高于未妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05）；妊娠组获卵数、IVF总受精率高于未妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 年龄＜35岁患者临床资料和卵泡液检测指标Tab.2 Clinical data and follicular fluid test indicators for patients＜35 years x±s

表2 年龄＜35岁患者临床资料和卵泡液检测指标Tab.2 Clinical data and follicular fluid test indicators for patients＜35 years x±s

项目BMI（kg/m2）基础AFC（个）基础FSH（IU/L）卵泡液AMH（pg/mL）卵泡液BMP-15（pg/mL）卵泡液Activin A（ng/L）Gn总量（IU）获卵数（个）IVF总受精率（%）ICSI总受精率（%）妊娠（n=30）21.4±2.8 14.2±3.9 7.0±2.0 841.9±108.8 32.3±8.1 70.5±24.0 2 603.3±1 079.4 13.4±5.0 87.8（184/221）78.7（118/150）未妊娠（n=40）21.3±2.0 12.7±4.2 7.7±1.5 730.0±135.3 23.3±10.5 82.7±25.7 2 603.1±824.4 11.2±4.1 77.2（268/347）84.9（62/73）P值0.869 0.115 0.102 0.000 0.000 0.048 0.999 0.041 0.002 0.285

2.4 预测价值分析

2.4.1 与卵巢反应性和年龄＜35岁患者妊娠结局相关的因素分析根据ANOVA分析的结果，采用多元有序Logistic回归分析可能对卵巢反应性产生影响的因素，校正混杂因素后显示，获卵数是影响卵巢反应性的独立因素，见表3。采用二元Logistic回归分析评估可能对年龄＜35岁患者妊娠结局产生影响的因素，校正混杂因素后显示，FFAMH、FFBMP-15是影响年龄＜35岁患者妊娠结局的独立因素，见表3。

表3 卵巢反应性及＜35岁患者妊娠结局Logistic回归分析Tab.3 The logistic regression analysis of ovarian responsiveness and pregnancy outcome in patients＜35 years

2.4.2 相关因素对年龄＜35岁患者妊娠结局的预测价值ROC曲线对比分析显示，FFBMP-15对妊娠结局预测的AUC（曲线下面积）为0.76，临界值为27.26、灵敏度和特异度分别为73%和72%，Youden指数为0.46；FFAMH对妊娠结局预测的AUC为0.748，临界值为736.8、灵敏度和特异度分别为87%和65%，Youden指数为0.52。FFBMP-15和FFAMH均是临床妊娠结局（＜35岁）的有效预测指标，FFBMP-15对妊娠的预测价值高于FFAMH对妊娠的预测价值。见表4。

3 讨论

女性个体的生殖力与卵泡发育密切相关，卵巢反应受卵巢储备功能等影响，临床妊娠的成功又有胚胎、子宫内膜及生殖内分泌共同作用。研究［8，10］表明卵泡颗粒细胞分泌 AMH、Activin A，AMH在初级至窦状卵泡都有表达、抑制始基卵泡激活，敲除AMH基因后会加速始基卵泡池的耗竭；Activin A促进颗粒细胞增殖、分化和卵母细胞生长，但增加卵泡凋亡［9］。BMP-15由卵母细胞特异分泌，促进卵泡及卵母细胞发育成熟，与胚胎发育正相关［3，8，11-12］。研究［1］表示卵巢局部因子，生长因子等调节失衡可能是影响卵巢反应甚至是妊娠结局的因素。研究［3-4，11］发现FFBMP-15水平与卵母细胞成熟、胚胎受精及发育有关，与卵巢反应性也相关；血清AMH是反应卵巢储备功能的最敏感指标［15］，既往研究表明［16］在拮抗剂方案中AMH对卵巢低反应及高反应有预测价值。本研究显示FFAMH水平在卵巢反应组间无明显差异；低、高反应组FFBMP-15水平均高于正常反应组，与卵巢反应性相关（P＜0.05），但FFBMP-15并非是影响卵巢反应的独立因素。与既往研究不一致［17］，本研究结果显示，年龄、基础AFC和基础FSH在不同卵巢反应患者中有组间差异，但均不能作为影响卵巢功能的独立因素，这可能与Logistic回归模型建立有关，既往多是卵巢低反应与正常反应的比对。

表4 相关因素对年龄＜35岁患者妊娠结局的预测价值Tab.4 The predictive value of relevant factors for pregnancy outcome in patients＜35 years

近来关于AMH能否预测临床妊娠结局一直存在争议［18-20］，最新发现Gn第5天血清AMH浓度亦可作为预测妊娠结局的指标［21］；同样FFAMH是否能作为妊娠结局的预测指标也存在争议［22-24］。本研究结果显示＜35岁妊娠组患者FFAMH浓度高于未妊娠组（P＜ 0.001），AUC为0.748，表明FFAMH是预测＜35岁患者妊娠结局的独立因素，这与最近研究一致［6］。动物实验［13-14］研究表明BMP-15体外培养卵母细胞成熟，IVF-ET后产仔率提高；本研究发现＜35岁患者妊娠组FFBMP-15浓度高于未妊娠组（P＜0.001），AUC为0.760，FFBMP-15是预测年妊娠结局（＜35岁）的独立因素。既往研究［25-26］表明Activin A是早期稽留流产的有效预测指标，本研究结果显示＜35岁患者妊娠组FFActivin A浓度低于未妊娠组（P=0.048），但Activin A不是影响妊娠结局（＜35岁）的独立因素，是否说明卵泡液Activin A的表达与妊娠无关，只与早期卵泡发育有关。因样本量关系，本研究只分析了年龄＜35岁患者妊娠结局的影响因素，对于≥35岁患者的研究有待收集更多的标本后进一步分析。

综上所述，在黄体中期长方案中，FFBMP-15和FFAMH是年龄＜35岁妊娠结局的有效独立预测指标；FFBMP-15在不同卵巢反应的组间表达有差异，也为BMP-15与卵巢发应的相关性研究提供了新的思路。受条件所限，本研究样本量较小，且相关血清指标未全面检测，所以血清和卵泡液指标与卵巢反应及妊娠结局的相关性还需扩大样本量深入研究证实。